Инструкция по микробиологическому контролю производства мороженого

3 сентября 1976 года

Основной задачей микробиологического контроля является обеспечение высокого качества продукции, выпускаемой предприятиями.

По результатам микробиологического контроля судят о санитарно-гигиеническом благополучии предприятия или имеющихся в этом отношении недостатках как в части условий производства (эффективность пастеризации смеси, качество мойки и дезинфекции оборудования и инвентаря и т.д.), так и в части качества готовой продукции.

Микробиологический контроль производства мороженого заключается в проверке качества поступающего сырья, материалов, припасов и готовой продукции, в выявлении возможных источников бактериального обсеменения мороженого по ходу технологического процесса, а также в проверке санитарно-гигиенических условий производства.

1.1. Подготовка посуды и материалов.

1.1.1. Вся новая посуда, предназначенная для микробиологических работ, кипятится в подкисленной воде (1 - 2-процентный раствор соляной кислоты) в течение 15 минут.

Вымытую посуду стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при 160 °С в течение 2 часов или паром в автоклаве при температуре 121 °С в течение 20 - 30 минут с последующим высушиванием.

121 °С = 1 ати, 116 °С = 0,7 ати, 112 °С = 0,5 ати.

Чашки Петри, пипетки и т.п. стерилизуют завернутыми в бумагу или в металлических пеналах. В верхнюю часть пипетки, которая берется в рот, предварительно вкладывают кусочки ваты. Колбы или пробирки закрывают ватными пробками и стерилизуют. Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками.

Примечание. В случае определения редуктазной пробы разрешается пользоваться посудой, которую непосредственно перед испытанием кипятят в дистиллированной воде в течение 30 минут.

1.1.2. Посуда с питательными средами после подсчета на них кишечной палочки, дрожжей, плесеней обеззараживается перед мойкой путем стерилизации в автоклаве при 121 °С в течение одного часа.

1.1.3. Изготовленные марлевые или ватные тампоны стерилизуют в отдельности завернутыми в бумагу или закрепляют на проволоке или деревянных палочках, пропущенных через ватную пробку, и вместе с пробкой вставляют в пробирки, тампоны не должны касаться раствора. Стерилизуют пробирки вместе с тампонами и 5 мл физиологического раствора при 121 °С в течение 20 минут.

1.2. Питательные среды и реактивы.

1.2.1. Физиологический раствор.

К 1 л водопроводной воды добавляют 8,5 г хлористого натрия, разливают раствор в чистые пробирки диаметром 18 - 20 мм по 10 мл, а в колбы - по 93 мл и стерилизуют при 121 °С в течение 20 минут. После стерилизации в пробирках остается обычно по 9 мл физиологического раствора, а в колбах - по 90 мл, т.е. такое количество, которое необходимо при приготовлении разведений из посевного материала.

1.2.2. Стерильная вода.

Водопроводную или другую питьевую воду наливают в чистые пробирки или колбы и стерилизуют при 121 °С в течение 20 минут.

1.2.3. Мясопептонный бульон.

Говяжье мясо, освобожденное от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, взвешивают, складывают в кастрюлю, смешивают с двойным количеством водопроводной воды и выдерживают 12 - 24 часа при температуре 4 - 6 °С. Для ускорения процессов экстракции питательных веществ содержимое кастрюли подогревают при 50 °С в течение 1 часа и затем кипятят 30 минут. После кипячения бульон в горячем состоянии фильтруют через двойной бумажный или ватно-марлевый фильтр. Фильтрат измеряют и добавляют к нему водопроводную воду до первоначального объема, 1% пептона и 0,5% поваренной соли.

Бульон обычно имеет кислую реакцию, поэтому его подщелачивают насыщенным раствором соды или 10-процентным раствором NaOH до pH 7,2 - 7,4. Чтобы бульон был прозрачным, к нему добавляют яичный белок (из расчета - белок одного яйца на 1 л), который предварительно взбивают с двойным количеством воды. Смесь нагревают в текучем пару 30 мин. белок при этом свертывается и увлекает с собой из жидкости взвешенную муть. Горячий бульон фильтруют через влажный двойной бумажный фильтр. Получается вполне прозрачная жидкость, которую разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют при 121 °С в течение 20 минут.

1.2.4. Мясопептонный агар.

Для приготовления плотной среды к мясопептонному бульону прибавляют 1,5% агара, предварительно измельченного, замоченного и хорошо промытого водой, и нагревают его в автоклаве до 121 °С (без выдержки). Среду в горячем состоянии фильтруют через вату, разливают в пробирки (по 10 - 12 мл) или колбы и стерилизуют при 121 °С в течение 10 минут. Мясопептонный агар может быть заменен сухим питательным агаром, среду из которого готовят по прописи, прилагаемой к каждой порции сухой среды. При получении каждой новой партии сухого питательного агара качество приготовленной из него среды должно контролироваться. Результаты, получаемые при посеве продукции на среду, приготовленную из сухого питательного агара, должны быть близкими к результатам, получаемым при посеве того же образца продукции на мясопептонный агар.

В случае несовпадения результатов к сухому питательному агару добавляют 1/4 - 1/3 часть мясопептонного бульона для приближения состава среды к мясопептонному агару.

1.2.5. Сусловый агар.

Сусло для приготовления питательной среды должно содержать 6 - 8% сахара. В случае излишнего содержания сахара в сусле его разбавляют водой до указанной нормы.

Содержание сахара в сусле определяют специальным ареометром с делениями от 1000 до 2000, считая каждые 5 делений равным 1% сахара. Сусло должно иметь pH 4,5.

Сусло стерилизуют при 121 °С в течение 10 минут. К суслу прибавляют 2% или 3% агара и плавят при 120 °С без выдержки, затем фильтруют через вату, разливают по колбам или пробиркам и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.

Примечание. Сусловый агар может быть заменен средой Сабуро (см. 1.2.6) или картофельно-глюкозным агаром (см. 1.2.7).

Если при длительном хранении сусловый агар подсыхает, то перед употреблением в него следует добавить воды до первоначального объема и вновь простерилизовать.

1.2.6. Среда Сабуро.

К 1 л дистиллированной воды добавляют 18 г агара и оставляют на 30 минут для его набухания; добавляют 40 г глюкозы или мальтозы и 10 г пептона, нагревают до 120 °С без выдержки; агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, среду разливают, стерилизуют при 115 °С в течение 15 минут.

1.2.7. Картофельно-глюкозный агар.

Очищенный и нарезанный ломтиками картофель весом 200 г заливают 1 л дистиллированной воды и кипятят в течение часа. Отвар фильтруют, к фильтрату добавляют воду до первоначального объема, 2% глюкозы и 3% агара.

Среду разливают по пробиркам (по 10 - 12 мл) или в колбы и стерилизуют при 121 °С в течение 10 минут.

При употреблении устанавливают pH = 3,5 при помощи 10-процентного стерильного раствора безводной лимонной кислоты при 45 °С.

Примечание. Для повышения элективности питательных сред, применяемых для учета дрожжей и плесеней, следует добавлять на 1 л среды 50000 ИЕ пенициллина и 40 мг стрептомицина или 350 мг неомицина. Растворы антибиотиков готовят на стерильной дистиллированной воде и добавляют в расплавленный и охлажденный агар непосредственно перед заливкой его в чашки Петри.

1.2.8. Среда Кесслер (модифицированная).

К 1 л водопроводной воды прибавляют 50 мл бычьей желчи (или желчи других сельскохозяйственных животных) и 10 г пептона; смесь кипятят 20 - 30 минут в водяной бане при помешивании, фильтруют через вату и затем прибавляют 2,5 г глюкозы. Доводят объем смеси водопроводной водой до 1 л; устанавливают реакцию среды (pH 7,4 - 7,6) и добавляют 2 мл 1-процентного водного раствора кристаллического фиолетового. Среду разливают в пробирки с поплавками (5 мл) или в колбы (50 мл) и стерилизуют при 121 °С в течение 10 минут. Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет.

Примечание. Может быть использована сухая среда Кесслер, которую готовят по прилагаемой к ней прописи: 1,6 г порошка всыпать в 100 мл холодной водопроводной воды, тщательно размешать, кипятить при помешивании 20 - 30 мин. в водяной бане и фильтровать через вату. Разлить в пробирки с поплавками и стерилизовать при 121 °С в течение 10 мин.

1.2.9. Твердая среда Кесслер.

К жидкой среде Кесслер добавляют 0,8% агара и плавят. Затем среду разливают по 7 - 8 мл в пробирки и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.

1.2.10. Среда Эндо.

а) К 100 мл расплавленного мясопептонного агара (pH 7,6 - 7,8), соблюдая стерильность, добавляют 1 г "Ч" лактозы, растворенной в 5 мл стерильной воды и подогретой на водяной бане при 100 °С в течение 5 минут.

б) В отдельную пробирку наливают 0,5 мл отфильтрованного 10-процентного

спиртового раствора основного фуксина, к которому добавляют

свежеприготовленный 10-процентный водный раствор сернокислого натрия

(Na SO х 7H O ) до получения бледно-розового окрашивания.

К расплавленному лактозному агару добавляют, избегая вспенивания, раствор "б" и разливают в чашки Петри. Среда Эндо должна быть свежеприготовленной. Рекомендуется пользоваться также сухой готовой средой Эндо.

1.2.11. Среда Козера (модифицированная).

К 1 л дистиллированной воды добавляют 1,5 г фосфорнокислого натрий-амония, 1,0 г фосфорнокислого однозамещенного калия, 0,2 г сернокислого магния, 2,5 - 3,0 г натрия лимоннокислого. Раствор стерилизуют в автоклаве при 121 °С в течение 15 минут (pH среды 6,8 - 6,9), добавляют к нему 10 мл 0,5-процентного спиртового раствора бромтимолового синего и разливают в стерильные пробирки. Цвет среды после добавления индикатора - изумрудно-зеленый.

1.2.12. Реактивы для окраски по Граму.

Реактив 1. К 100 мл этилового спирта добавляют 0,5 г кристаллического фиолетового.

Реактив 2. К 96 мл 0,5-процентного спиртового раствора йодистого калия добавляют 2 мл 5-процентного спиртового раствора основного фуксина и 2 мл 5-процентного спиртового раствора йода.

Примечание. Растворение йодистого калия в спирте рекомендуется проводить в водяной бане при температуре 45 - 50 °С при постоянном помешивании.

1.2.13. Раствор метиленового голубого.

Для приготовления насыщенного спиртового раствора смешивают 10 г метиленового голубого со 100 мл 96-процентного этилового спирта. Смесь ставят в термостат при температуре 37° на 24 часа, а затем фильтруют. Рабочий раствор метиленового голубого для редуктазной пробы готовят следующим образом: к 5 мл насыщенного спиртового раствора прибавляют 195 мл дистиллированной воды, смесь перемешивают.

Раствор метиленового голубого для окрашивания препарата: к 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового голубого прибавляют 100 мл 0,01-процентного водного раствора КОН. Рабочий раствор метиленового голубого сохраняют в склянках из темного стекла до 7 суток, насыщенный раствор - до 3 месяцев. Можно использовать готовый раствор фиксанала.

1.2.14. Раствор резазурина.

100 мг резазурина растворяют в 200 мл прокипяченной и охлажденной дистиллированной воды. Этот раствор является основным и его используют для приготовления рабочего раствора. Срок хранения основного раствора резазурина не более 30 суток при температуре 8 - 10 °С. Основной раствор используется для определения бактериальной обсемененности сырых сливок.

Рабочий раствор резазурина приготовляют из основного раствора разбавлением последнего прокипяченной и охлажденной дистиллированной водой в соотношении 1:2,5 (например, к 10 мл основного раствора прибавляют 25 мл воды).

Рабочий раствор содержит 0,014% резазурина. Срок хранения рабочего раствора резазурина не более 7 суток при температуре не выше 8 - 10 °С.

Резазурин, его основной и рабочий растворы хранят в банках, защищенных от света, или из темного стекла.

1.3. Подготовка помещений для микробиологических исследований.

Посевы производят в боксе (в помещении для проведения микробиологических исследований).

При отсутствии специального бокса допускается проведение анализов в лабораторной комнате, в которой во время анализа должны быть закрыты форточки и дверь во избежание движения воздуха.

Дезинфекцию помещений проводят протиранием всех поверхностей хлорными или дезинфицирующими препаратами по соответствующей для каждого препарата инструкции. За 2 - 3 часа до начала работы включают бактерицидные лампы (пребывание людей в помещении с включенными бактерицидными лампами запрещается).

1.4. Отбор проб, подготовка их к анализу и приготовление разведений.

Отбор проб молока и молочных продуктов для микробиологических исследований проводится в соответствии с ГОСТ 9225 и ГОСТ 3226-68 с регистрацией номера исследуемой партии в лабораторном журнале.

При отборе проб для микробиологических исследований на предприятиях работниками СЭС необходимо, чтобы микробиолог завода (хладокомбината) одновременно отбирал те же пробы и исследовал их.

1.4.1. Пробы для микробиологического анализа продуктов и материалов отбирают до отбора проб для физико-химических исследований.

Посуду с образцом закрывают стерильной ватной или притертой стеклянной пробкой и снабжают этикеткой, в которой указывают номер образца и партии, наименование продукта, дату отбора пробы и т.д.

Исследование образцов должно проводиться немедленно. В случае необходимости образцы сохраняют до начала исследования не более 4 часов при температуре не выше +6°.

От нерасфасованного мороженого стерильной ложечкой или щупом отбирают образец массой 50 г.

От расфасованных продуктов отбирают 1 - 2 образца в упаковке.

Образцы развертывают, помещают в стерильную посуду с притертой или ватной пробкой.

В случае необходимости образцы сохраняют до начала исследования не более 4 часов при температуре не выше -2 °С.

Перед исследованием посуду, в которой находится образец, нагревают в водяной бане при 40 - 45 °С в течение 10 - 15 мин. Проба мороженого отбирается после его полного расплавления и удаления воздушных пузырьков. Из подготовленной пробы мороженого готовят необходимые разведения в стерильном физиологическом растворе или стерильной водопроводной воде с температурой 40 - 45 °С. Для этого 1 мл расплавленного мороженого вносят в 9 мл физиологического раствора. Таким образом получают разведение продукта в 10 раз. Для получения разведения продукта в 100 раз новой пипеткой берут из разведения в 10 раз 1 мл и вносят в 9 мл стерильного физиологического раствора. Последующие разведения готовят таким же образом, каждый раз применяя новую пипетку.

1.4.3. Молоко и сливки.

При отборе проб молока для определения редуктазы руководствуются основными понятиями и общими правилами отбора проб по ГОСТ 13928-68 "Молоко и сливки изготовляемые. Отбор и подготовка их к анализу". Отбор проб для определения редуктазы производят после отбраковки молока, не подлежащего приемке по кислотности, согласно ГОСТ 13264-70 "Молоко коровье. Требования при заготовках".

Отбор проб молока и сливок в количестве около 50 мл производят после тщательного перемешивания стерильным пробоотборником или черпаком в стерильную посуду с пробкой.

Мутовку, черпак или пробоотборник обрабатывают путем хлорирования (200 мг активного хлора на 1 л воды).

Взятый образец должен тотчас же подвергаться исследованию. Если молоко и сливки исследуют не сразу, их хранят при температуре не выше +6 °С не более 4 часов с момента отбора пробы. Разведения для посева проводят согласно п. 1.4.1.

Пробу отбирают стерильным щупом на расстоянии 3 - 5 см от края образца, направляя щуп к противоположной стороне и опуская примерно на 3/4 его длины. Из щупа отбирают стерильным шпателем около 20 г масла и помещают пробу в стерильную посуду.

При отборе проб масла из мелкой расфасовки берут навеску около 20 г (включая поверхностный слой). Образец помещают в посуду, расплавляя в водяной бане, нагретой до 40 - 45 °С. Из расплавленного масла после тщательного перемешивания готовят необходимые для посева разведения согласно п. 1.4.1.

1.4.5. Сгущенное молоко или сливки с сахаром, какао или кофе со сгущенным молоком и сахаром.

От однородной партии продукта, расфасованного в банки, бочки, фляги, отбирают образец весом 50 г. Банки с продуктом перед анализом тщательно моют и вытирают. Перед вскрытием крышку банки, пробку бочки и часть днища вокруг пробки фломбируют. Содержимое банки перемешивают и делают навеску 10 г продукта в колбу с 90 мл стерильного физиологического раствора, подогретого до 45 °С. Смесь тщательно перемешивают до полного растворения, получают разведение в 10 раз. Отсюда делают последующие разведения.

1.4.6. Сухое молоко, сухие сливки с сахаром и др. сухие молочные продукты.

Из мешка или бочки стерильной ложкой отбирают из разных мест пробу продукта в количестве 50 г и помещают в стерильную сухую тару. Если продукция расфасована в банки или коробки, то от каждой партии отбирают два образца в оригинальной упаковке. Затем отвешивают 10 г продукта на профламбированном часовом стекле или на стерильном куске пергамента. Навеску высыпают в колбу с 90 мл стерильного физиологического раствора, подогретого до 45 °С, тщательно взбалтывают до полного растворения. Таким образом получают разведение продукта в 10 раз, откуда делают последующие разведения.

1.4.7. Сахар, сахарный сироп, стабилизаторы.

Проба отбирается в сухую стерильную посуду из разных мест одной партии. Для анализа навеску 10 г помещают в 90 мл стерильного физиологического раствора. Из этого разведения делают посев 1 мл и последующие разведения.

1.4.8. Фрукты, ягоды, орехи и др.

Проба отбирается в стерильную сухую посуду. Для анализа навеску 10 г помещают в 90 мл стерильной воды или физиологического раствора и встряхивают. Из этого разведения делают посев 1 мл на соответствующие среды и последующие разведения.

1.4.9. Глазурь, крем, пралине и другие полуфабрикаты.

Проба для анализа отбирается в количестве около 20 г в стерильную посуду и расплавляется на водяной бане при 40 - 45 °С. Из расплавленного продукта после тщательного перемешивания отбирают 1 мл и помещают в 9 мл физиологического раствора, подогретого до 40 - 45 °С. Отсюда делают последующие разведения согласно п. 1.4.1.

Контроль сырья и готовой продукции (определения общего количества бактерий, определение бактерий группы кишечной палочки, просмотр микроскопических препаратов) проводится по ГОСТ 9225-68. Негостированные методы используются для внутриведомственного контроля.

2.1. Определение общего количества бактерий.

2.1.1. Общее количество бактерий в исследуемом материале определяется в 1 мл (или 1 г продукта) или в 1 мл смыва при посеве на чашки Петри. Перед посевом делают надписи на крышке чашки с указанием объекта исследования, разведения и даты анализа.

Из каждого разведения 1 мл (в соответствии с табл. 1) вносится в чашку Петри и заливается расплавленным и остуженным до 45 °С мясопептонным агаром.

Сразу после заливки агаром содержимое чашки следует тщательно перемешать путем легкого вращательного движения для равномерного распределения посевного материала. После застывания агара чашки Петри перевертывают крышками вниз и ставят для выращивания в термостат при температуре +37 °С на 48 часов.

2.1.2. Подсчитывают количество выросших в каждой чашке колоний. При этом для подсчета берут те чашки, количество колоний в которых не более 300.

В отдельных случаях при большом числе колоний дно чашки Петри делят на 4 и более одинаковых секторов, подсчитывают число колоний в 2 - 4 секторах, находят среднее арифметическое число колоний для них, которое умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом находят общее количество колоний, выросших на одной чашке.

Число колоний, выросших на каждой чашке, пересчитывают на 1 г или 1 мл продукта с учетом разведения. Окончательным результатом будет среднее арифметическое от результатов подсчета колоний в отдельных чашках.

2.2. Проба на редуктазу с применением метиленового голубого (органический краситель).

2.2.1. В процессе жизнедеятельности бактерии выделяют в окружающую среду, наряду с другими окислительно-восстановительными ферментами, анаэробные дегидразы (редуктазы). Существует некоторое соответствие между общим количеством бактерий в молоке и содержанием в нем редуктаз, что дает возможность использовать редуктазную пробу как косвенный показатель бактериальной обсемененности сырого молока.

2.2.2. В пробирки (180 х 20 мм) наливают по 1 мл рабочего раствора метиленового голубого и по 20 мл исследуемого молока, нагретого до 38 - 40 °С, закрывают резиновыми пробками, смешивают путем медленного 3-кратного переворачивания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник, водяную баню или термостат при температуре 38 - 40 °С (уровень воды в бане должен быть выше уровня в пробирке). Момент погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа. Наблюдение за изменением окраски ведут через 20 минут, 2 часа и 5 час. 30 мин.

Окончанием анализа считается момент обесцвечивания окраски молока, при этом остающийся небольшой кольцеобразный окрашенный слой вверху (около 1 см) или небольшое окрашивание части внизу пробирки в расчет не принимаются. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают.

2.2.3. По времени обесцвечивания содержимого пробирки определяют бактериальную обсемененность и класс молока в соответствии с таблицей 2.

¦ Класс ¦ Оценка качества ¦ Продолжительность ¦ Количество бактерий ¦

¦ ¦ молока ¦ обесцвечивания ¦ в 1 мл молока ¦

¦ I ¦ Хорошее ¦ свыше 5 ч 30 мин. ¦ менее 500 тыс. ¦

¦ II ¦ Удовлетворительное ¦ свыше 2 до 5 ч 30 мин. ¦ от 500 тыс. до 4 млн. ¦

¦ III ¦ Плохое ¦ свыше 20 мин. до 2 ч ¦ от 4 млн. до 20 млн. ¦

¦ IV ¦ Очень плохое ¦ 20 мин. и менее ¦ более 20 млн. и выше ¦

2.3. Проба на редуктазу с применением резазурина.

В этой пробе для определения содержания в молоке (сливках) редуктаз используют свойство резазурина быстро изменять свою окраску при восстановлении. Оценку качества молока при пробе с резазурином получают в течение одного часа, а молоко с особо высокой бактериальной обсемененностью может быть выявлено через 20 минут.

В пробирки наливают 1 мл рабочего раствора резазурина и 10 мл исследуемого молока, закрывают резиновыми пробками, смешивают путем медленного трехкратного перевертывания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник или водяную баню. Вода должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Температура воды в редуктазнике после погружения пробирок с молоком должна поддерживаться в течение всего времени в пределах 38 - 40 °С. Пробирки с молоком и резазурином на протяжении анализа должны быть защищены от прямых солнечных лучей.

Примечание. Анализ сливок проводят так же, как и анализ молока, но добавляют 1 мл основного раствора резазурина.

Время погружения пробирок в баню считают началом анализа. Показания снимают через 20 минут и через 1 час, не встряхивая и не переворачивая пробирки. Молоко, обесцвечивающееся через 20 минут, относят к IV классу, и оно дальнейшему исследованию не подлежит.

Пробирки с таким молоком удаляют из редуктазника. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают. Оставшиеся пробирки однократно переворачивают и оставляют в редуктазнике или водяной бане до конца анализа.

В зависимости от времени обесцвечивания и изменения окраски молоко (сливки) относят к одному из четырех классов в соответствии с таблицей 3.

¦ Класс ¦ Оценка качества ¦ Продолжи- ¦ Окраска молока ¦ Количество бактерий ¦

¦ ¦ молока (сливок) ¦ тельность ¦ (сливок) ¦ в 1 мл молока ¦

¦ I ¦ Хорошее ¦ Через 1 ч ¦ Сине-стальная ¦ Менее 500 тыс. ¦

¦ II ¦ Удовлетворительное ¦ Через 1 ч ¦ Сиреневая или ¦ От 500 тыс. ¦

¦ ¦ ¦ ¦ сине-фиолетовая ¦ до 4 млн. ¦

¦ III ¦ Плохое ¦ Через 1 ч ¦ Розовая или белая ¦ От 4 млн. ¦

¦ IV ¦ Очень плохое ¦ До 20 ¦ Белая ¦ От 20 млн. ¦

2.4. Определение бактерий группы кишечной палочки.

2.4.1. Для характеристики санитарно-гигиенических условий производства и готовой продукции определяют степень обсеменения исследуемых объектов бактериями группы кишечной палочки, т.е. бродильный титр и коли-титр. Бродильный титр - это наименьшее количество продукта, выраженное в граммах или миллилитрах, в котором обнаружена хотя бы одна бактерия группы кишечной палочки, т.е. разлагающая глюкозу на кислоту и газ при 43 °С в течение 24 часов (первая бродильная проба в среде Кесслер). Коли-титр - это наименьшее количество продукта, выраженное в граммах или миллилитрах, в котором обнаружена кишечная палочка (после идентификации).

2.4.2. Посев в среду Кесслер (первая бродильная проба) производят из разведений продуктов в объемах, указанных в таблице 1.

По 1 мл из указанных разведений продукта засевают в пробирки со средой Кесслер. Пробирки с посевом помещают в термостат при температуре 43 °С на 18 - 24 часа. При исследовании мороженого пробирки с посевами выдерживают при 43 °С в течение 48 часов. Затем пробирки с посевами просматривают и устанавливают бродильный титр.

Примечание. При внутризаводском микробиологическом контроле сырья, полуфабрикатов, готовой продукции допускается ограничивать исследование на наличие бактерий группы кишечной палочки определением только бродильного титра (по первой бродильной пробе). При отсутствии газообразования продукт считают не загрязненным кишечной палочкой.

2.4.3. При контроле продуктов, нормированных по содержанию кишечной палочки, из пробирок с посевами в среду Кесслер, в которых обнаружено газообразование, проводят выделение чистой культуры кишечной палочки и ее идентификацию.

2.4.4. Идентификацию кишечной палочки проводят следующим образом. Из пробирок с газообразованием производят высев на среду Эндо с таким расчетом, чтобы получить отдельные колонии, для чего берут петлей минимальное количество посевного материала и производят посев штрихом. Перед посевом дно чашки с подсушенной средой Эндо делят на 4 сектора. Посев из каждой пробирки с газообразованием со средой Кесслер производят на отдельный сектор. Чашки с посевами помещают (крышками вниз) в термостат с температурой 37 °С на 18 - 24 ч.

Примечание. Если газообразование обнаружено в пробирках с большим разведением и отсутствует в пробирках с предыдущим разведением, то на среду Эндо высевают материал из всех пробирок с предыдущим разведением.

При отсутствии на среде Эндо колоний, типичных для бактерии группы кишечной палочки (красных, нередко с металлическим блеском, розовых, бледно-розовых), продукт считают не загрязненным кишечной палочкой. При наличии на среде Эндо колоний, типичных для бактерий группы кишечной палочки, а также бесцветных, проводят их изучение.

При систематическом обнаружении бесцветных колоний на чашках с агаром Эндо в условиях работы лабораторий, расположенных на территории предприятия, во избежание пропуска патогенных бактерий кишечной группы следует обращаться в лаборатории санитарно-эпидемиологических станций.

2.4.5. Из изолированных колоний, характерных для бактерий группы кишечной палочки, делают препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют.

Для приготовления препарата на чистое и охлажденное после фламбирования предметное стекло наносят петлей каплю дистиллированной воды, в которую вносят петлей небольшое количество агаровой культуры, не размешивая в воде. При приготовлении препарата из жидкой культуры на стекло наносят каплю ее. Затем вносят также петлей каплю реактива 1 (см. п. 1.2.13). Смесь распределяют на участке примерно в 1 кв. см, подсушивают при комнатной температуре и фиксируют, медленно проводя один раз через пламя горелки.

На одном стекле можно готовить 6 - 8 мазков, отделяя их один от другого линиями, проведенными с лицевой стороны стекла. Препарат ополаскивают водой и тщательно просушивают фильтровальной бумагой.

После просушивания на препарат наносят с избытком реактив 2 так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность стекла. Продолжительность окрашивания 0,5 - 1 мин. После окрашивания препарат быстро ополаскивают проточной водой, направляя струю под углом на стекло, помещенное вертикально. Препарат высушивают фильтровальной бумагой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Микробы, красящиеся по Граму (грамположительные), будут темно-фиолетового цвета, микробы, не красящиеся по Граму (грамотрицательные), будут красного цвета. Бактерии группы кишечной палочки - короткие грамотрицательные палочки.

2.4.6. Посев на среду Козера.

Из одной и той же колонии грамотрицательных палочек с каждого сектора среды Эндо производят высевы петлей на среду Козера. Пробирки с посевами на среде Козера помещают в термостат при температуре 37 °С на 18 - 24 час.

2.4.7. Отсутствие роста на среде Козера указывает на наличие цитрат-отрицательных разновидностей бактерий группы кишечной палочки.

Изменение оливково-зеленого цвета среды Козера на васильковый свидетельствует о том, что обнаруженные бактерии кишечной палочки относятся к цитрат-положительным разновидностям, которые не учитывают. В результате идентификации учитывают все разновидности кишечной палочки, не окрашивающиеся по Граму и вызывающие брожение с образованием кислоты и газа в среде Кесслер при 43 °С; не учитывают разновидности, дающие рост на цитратной среде Козера.

2.4.8. Вычисление коли-титра для мороженого (см. табл. 4).

Инструкция по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышленности, Приказ Минмясомолпрома СССР от 07 мая 1976 года

СОГЛАСОВАНА Заместитель Главного Государственного санитарного врача СССР А.И.Заиченко 5 января 1976 г.

УТВЕРЖДЕНА Заместитель Министра мясной и молочной промышленности СССР М.Г.Лушин 7 мая 1976 г.

Настоящая инструкция по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышленности составлена Всесоюзным научно-исследовательским институтом молочной промышленности совместно с Всесоюзным научно-исследовательским институтом маслодельной и сыродельной промышленности.

Основной задачей микробиологического контроля в молочной промышленности является обеспечение выпуска продукции высокого качества, повышение ее вкусовых и питательных достоинств.

Микробиологический контроль на предприятиях молочной промышленности заключается в проверке качества поступающих молока, сливок, материалов, закваски, готовой продукции, а также соблюдении технологических и санитарно-гигиенических режимов производства.

При контроле качества сырья необходимо обращать внимание на его общую бактериальную обсемененность и при производстве сыра - на содержание маслянокислых бактерий, при контроле эффективности пастеризации - на содержание бактерий группы кишечной палочки (отсутствие в 10 мл), при контроле заквасок - на их микробиологическую чистоту и активность.

В целях обеспечения выпуска продукции в строгом соответствии с требованиями нормативно-технической документации (ГОСТ, ОСТ, ТУ и др.) большое внимание должно уделяться контролю качества готовой продукции и в случаях его ухудшения - контролю технологических режимов производства с целью определения мест и интенсивности микробиологического обсеменения технически вредной микрофлорой.

Результаты микробиологического исследования качества готовой продукции в отличие от результатов физико-химического исследования из-за длительности анализов не могут быть использованы для задержки выпуска цельномолочной продукции, но по ним судят о санитарно-гигиеническом благополучии предприятия, о целенаправленности микробиологических процессов в технологии производства молочных продуктов, деятельности полезных микроорганизмов и микробиологических причинах появления пороков продукции.

В целях улучшения санитарно-технического режима на предприятиях микробиологическую оценку качества готовой продукции, мойки и дезинфекции технологического оборудования, а также личной гигиены следует включать в оценку качества труда цехового персонала при выплате премиальных доплат.

При организации микробиологического контроля следует руководствоваться настоящей инструкцией по микробиологическому контролю на предприятиях молочной промышленности, а также нормативно-технической документацией на сырье, молочную продукцию, технологическими инструкциями, санитарными правилами, инструкцией по мойке и дезинфекции технологического оборудования, утвержденными положениями об ОТК (лаборатории), микробиологах городских молочных, молочноконсервных и маслодельно-сыродельных заводов и комбинатов.

Настоящая инструкция касается микробиологического контроля сырого молока, сливок, готовой продукции предприятий молочной промышленности (за исключением стерилизованного молока и мороженого), используемых в производстве вспомогательных материалов, контроля по ходу технологического процесса, а также контроля санитарно-гигиенического состояния производства и воздуха рабочих помещений.

1. ПОДГОТОВКА К ИССЛЕДОВАНИЮ

1.1.1. Вся новая посуда, предназначенная для бактериологических работ, кипятится в подкисленной воде (1-2%-ный раствор соляной кислоты в течение 15 мин).

Посуда с питательными средами после подсчета на них кишечной палочки, дрожжей, плесеней и маслянокислых бактерий обеззараживается перед мойкой путем стерилизации в автоклаве при 121 °С в течение 30 мин или кипячением в течение 1 ч.

1.1.2. Вымытую посуду стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при 160 °С в течение 2 ч или паром в автоклаве при 121 °С в течение 20-30 мин с последующим подсушиванием. Перевод давления, показываемого манометром автоклава, в температуру проводится следующим образом:

Чашки Петри, пипетки и т.п. стерилизуют завернутыми в бумагу или в пеналах. В верхнюю часть пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты.

Каучуковые пробки стерилизуют отдельно в автоклаве завернутыми в бумагу (каждая порознь). Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками.

При отсутствии автоклава посуду и пробирки, предназначенные для проведения редуктазной пробы, кипятят в дистиллированной воде (или конденсате) в течение 30 мин или хлорируют с последующим ополаскиванием питьевой водой. Кипячение и хлорирование проводят непосредственно перед испытанием.

1.1.3. Изготовленные ватные или марлевые тампоны стерилизуют каждый в отдельности завернутыми в бумагу. Отдельно стерилизуют пробирки с 3-4 мл физраствора при температуре 121 °С в течение 20 мин.

Тампон может быть закреплен на проволоке или деревянной палочке, пропущенной через ватную пробку. В этом случае его вместе с пробкой вставляют в пробирку с 3-4 мл физиологического раствора (тампон не должен касаться раствора) и все вместе стерилизуют при 121 °С в течение 20 мин.

1.2.1. Физиологический раствор. К 1 л водопроводной воды добавляют 8,5 г хлористого натрия, разливают раствор по 10 мл в чистые пробирки диаметром 18-20 мм, а в колбы по 93 мл и стерилизуют при 121 °С в течение 20 мин. После стерилизации в пробирках остается обычно по 9 мл физиологического раствора, а в колбах - по 90 мл, т.е. такое количество, которое необходимо для приготовления разведений из посевного материала.

1.2.2. Мясо-пептонный бульон. Говяжье мясо, освобожденное от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, взвешивают, складывают в кастрюлю, смешивают с двойным количеством водопроводной воды и ставят на 12-14 ч при температуре 4-6 °С. Для ускорения процессов экстракции питательных веществ содержимое кастрюли прогревают при 50 °С в течение 1 ч и затем кипятят 30 мин. После кипячения бульон в горячем состоянии фильтруют через двойной бумажный или ватно-марлевый фильтр. Фильтрат измеряют и добавляют к нему водопроводную воду до первоначального объема, 1% пептона и 0,5% поваренной соли. После установления реакции (рН 7,2-7,4) (см. 1.2.24) бульон разливают в колбы и стерилизуют при 121 °С в течение 20 мин. Бульон перед использованием фильтруют через складчатый фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.

1.2.3. Мясо-пептонный агар. К мясо-пептонному бульону прибавляют 1,5% агара, предварительно измельченного, замоченного и хорошо промытого водой, и нагревают в автоклаве до 121 °С (без выдержки). Среду в горячем состоянии фильтруют через вату, разливают в пробирки (по 10-15 мл) или бутылки и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.

Мясо-пептонный агар может быть заменен сухим питательным агаром, среду из которого готовят по прописи, прилагаемой к каждой порции сухой среды: 5 г порошка всыпать в 100 мл холодной воды, тщательно размешать. Кипятить на слабом огне 1-2 мин с закрытой крышкой или пробкой при помешивании до полного расплавления агара, не допуская пригорания. Профильтровать, разлить в пробирки или бутылки, стерилизовать 20 мин при 121 °С или 30 мин текучим паром 3 дня подряд*.
______________
* Увлажнение, комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о понижении его качества.

При получении каждой новой партии сухого питательного агара качество приготовленной из него среды должно контролироваться. Результаты, получаемые при посеве продукции на среду, приготовленную из сухого питательного агара, должны быть близкими к результатам, получаемым при посеве того же образца продукции на мясо-пептонный агар. В случае, если посев на среду, приготовленную из сухого питательного агара, дает неудовлетворительные результаты, к этой среде добавляют часть мясо-пептонного бульона для приближения ее состава к МПА.

1.2.4. Молочный агар. Приготавливают 2%-ный водный агар и обезжиренное молоко. Обе среды стерилизуют отдельно при 121 °С в течение 10 мин.

При употреблении к расплавленному агару добавляют 20% обезжиренного молока и после тщательного перемешивания смесь выливают в чашки Петри.

1.2.5. Стерильное молоко. Обезжиренное молоко (кислотность 16-18 °Т) разливают в пробирки ( часть их емкости) и затем стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.

1.2.6. Сусло. Для подсчета плесеней и дрожжей используют неохмеленное пивное сусло. В нем предварительно определяют содержание сахара специальным ареометром с делениями от 1000 до 2000, считая каждые 5 делений равными 1% сахара. В случае излишнего содержания сахара сусло разбавляют водой до концентрации сахара 6-8%, разливают в колбы и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин. Сусло должно иметь слабокислую реакцию (рН 4,5), благоприятную для роста плесеней.

1.2.7. Сусловый агар. К суслу прибавляют 2 или 3% агара и плавят его, поднимая температуру до 120 °С (без выдержки), затем фильтруют через вату, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин*.

1.2.8. Картофельно-глюкозный агар. Очищенный и нарезанный ломтиками картофель весом 200 г заливают 1 л дистиллированной воды и кипятят в течение 1 ч. Отвар фильтруют, к фильтрату добавляют воду до первоначального объема, 2% глюкозы и 3% агара. Среду разливают по пробиркам (по 10-12 мл) или в колбы и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин. При употреблении устанавливают рН 3,5 при помощи 10%-ного стерильного раствора безводной лимонной кислоты*.

1.2.9. Среда Сабуро. К 1 л дистиллированной воды добавляют 18 г агара и оставляют на 30 мин для его набухания, затем добавляют 40 г мальтозы или глюкозы и 10 г пептона и плавят среду, поднимая температуру до 120 °С (без выдержки). Давлению дают упасть, расплавленную среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают и стерилизуют при 115 °С в течение 15 мин*.
______________
* Для повышения элективности питательных сред, применяемых для учета дрожжей и плесеней, следует добавлять на 1 л среды 50000 Е пенициллина и 40 мг стрептомицина или 350 мг неомицина. Растворы антибиотиков готовят на стерильной дистиллированной воде и добавляют в расплавленный охлажденный агар непосредственно перед заливкой его в чашки Петри.

1.2.10. Гидролизованное молоко. Обычное или восстановленное обезжиренное молоко кипятят и охлаждают до 45 °С. После установления рН 7,6-7,8 к 1 л молока добавляют 0,5-1,0 г порошка панкреатина или 2-3 г поджелудочной железы, пропущенной несколько раз через мясорубку (порошок панкреатина предварительно разводят в небольшом количестве теплой воды). Затем к молоку добавляют 5 мл хлороформа. Колбу закрывают корковой пробкой и выдерживают при 40 °С в течение 18-24 ч. В течение первых часов молоко несколько раз перемешивают (пробку после встряхивания приоткрывают для удаления паров хлороформа). Через 18-24 ч колбу вынимают из термостата, гидролизованное молоко фильтруют через бумажный фильтр, разводят в 2-3 раза водой, устанавливают рН 7,0-7,2 и стерилизуют 15 мин при 121 °С.

1.2.11. Агар с гидролизованным молоком. К приготовленному гидролизованному молоку добавляют 1,5% агара. Смесь расплавляют при 121 °С 15 мин, фильтруют через вату (в теплом автоклаве), разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 121 °С 10 мин.

1.2.12. Среда Кесслер (модифицированная). К 1 л водопроводной воды добавляют 50 мл бычьей желчи [или желчи других сельскохозяйственных животных, или медицинской желчи (билиарина)] и 10 г пептона; смесь кипятят 20-30 мин в водяной бане при перемешивании, фильтруют через вату и затем прибавляют 2,5 г глюкозы. Доводят объем смеси водопроводной водой до 1 л, устанавливают реакцию среды (рН 7,4-7,6) и добавляют 2 мл 1%-ного водного раствора кристаллического фиолетового. Среду разливают в пробирки (по 5 мл) или колбы (по 50 мл) с поплавками.

Стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин. Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет.

Примечание. Может быть использована сухая среда Кесслер, которую готовят по прописи, прилагаемой к каждой партии среды:

1,6 г порошка всыпать в 100 мл холодной водопроводной воды, тщательно размешать, кипятить, помешивая 20-30 мин в водяной бане, и фильтровать через вату. Разлить в пробирки с поплавками и стерилизовать при 121 °С в течение 10 мин.

1.2.13. Плотная среда Кесслер. К жидкой среде Кесслер добавляют 0,8% агара, среду плавят, а затем фильтруют. Расплавленную среду разливают по 7-8 мл по пробиркам и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.

1.2.14. Среда Эндо. К 100 мл расплавленного мясо-пептонного агара (рН 7,6-7,8), соблюдая стерильность, добавляют 1 г лактозы (ч), растворенной в 5 мл стерильной воды и подогретой на водяной бане при 100 °С в течение 5 мин. В отдельную пробирку наливают 0,5 мл отфильтрованного 10%-ного спиртового раствора основного фуксина, к которому добавляют свежеприготовленный 20%-ный раствор (водный) сернистокислого натрия (Na SO ·7H O) до получения бледно-розового окрашивания. Полученную таким образом смесь добавляют в расплавленный лактозный агар (избегая вспенивания) и разливают в чашки Петри. Среда Эндо должна быть свежеприготовленной. Рекомендуется пользоваться сухой готовой средой Эндо.

1.2.15. Среда Козера (модифицированная). К 1 л дистиллированной воды добавляют 1,5 г фосфорнокислого натрийаммония; 1,0 г фосфорнокислого однозамещенного калия; 0,2 г сернокислого магния; 2,5-3,0 г лимоннокислого натрия, рН среды 6,8-6,9. Раствор стерилизуют в автоклаве при 121 °С в течение 15 мин, добавляют к нему 10 мл 0,5%-ного спиртового раствора бромтимолового синего и разливают в стерильные пробирки, цвет среды после добавления индикатора - изумрудно-зеленый.

1.2.16. Реактивы для окраски по Граму. Реактив 1. К 100 мл этилового спирта добавляют 0,5 г кристаллического фиолетового.

Реактив 2. К 96 мл 0,5%-ного спиртового раствора йодистого калия добавляют 2 мл 5%-ного спиртового раствора основного фуксина и 2 мл 5%-ного спиртового раствора йода.

Примечание. Растворение йодистого калия в спирте рекомендуется проводить в водяной бане при 45-60 °С при постоянном помешивании.

1.2.17. Среда для определения маслянокислых бактерий. По 5 мл цельного или обезжиренного молока разливают в пробирки (пробирки с 1-1,5 г парафина должны быть стерильными) и затем стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин. Для обогащения среды к молоку до стерилизации можно добавить 0,5-1,0 г глюкозы и 0,5% цистеина.

1.2.18. Среда для обнаружения анаэробов (СДА). Для обнаружения маслянокислых бактерий в молочных продуктах используется также среда следующего состава, %: глюкоза - 0,5; ацетат - 0,5; дрожжевой автолизат - 2; растворимый крахмал - 0,1; цистеин - 0,05; агар-агар - 0,05; гидролизованное молоко - до 100.

Примечание. Цистеин может быть заменен менее дефицитной аскорбиновой кислотой (0,1%).

Среду стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин; рН после стерилизации - 7,1-7,2.

Если СДА используется как плотная питательная среда, то количество агара в ней увеличивается до 1,5%.

Перед употреблением СДА кипятится 20 мин для удаления растворенного в ней кислорода.

1.2.19. Дрожжевой автолизат. 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 л воды и помещают в термостат при 55-58 °С на 3 дня. После того помещают в автоклав при 118 °С в течение 15 мин. Затем фильтруют, осадки промывают таким количеством воды, чтобы общее количество фильтрата составляло 4 л.

Фильтрат нейтрализуют 20%-ным раствором едкого натрия до рН 6,8, разливают в пробирки и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.

1.2.20. Среда для обнаружения липолитических бактерий. К 100 мл водопроводной воды добавляют 1 г пептона, 0,3 г дрожжевого автолизата и 1,5 г агар-агара; смесь кипятят 20 мин, фильтруют через вату, доводят объем смеси водопроводной водой до 100 мл и прибавляют 0,1 г двузамещенного фосфорнокислого натрия (Na HPO ). Затем устанавливают реакцию среды (рН 7,0-7,4), разливают в колбы (по 100 мл) или в пробирки (по 10-15 мл) и стерилизуют при 121 °С в течение 15 мин. Отдельно готовят говяжий жир, расплавляют его, разливают по 5 мл по пробиркам, затем стерилизуют при 121 °С в течение 15 мин.

1.2.21. Определение активной кислотности (рН) среды. Для определения рН питательной среды применяют электрометрический или колориметрический методы. Электрометрическое определение проводят на потенциометре или рН-метре по прилагаемым к ним инструкциям.

Колориметрическое определение проводят с помощью индикаторных бумажек (ориентировочно), готового универсального индикатора или раствора индикатора, приготовляемого в лабораторных условиях.

Для установления рН применяют 0,04%-ный раствор бромтимолового синего или бромкрезолпурпура. Индикаторы готовят следующим способом: 0,1 г соответствующего индикатора, взвешенного на аналитических весах, растирают в ступке с N раствором NaOH. Для растворения 0,1 г бромтимолового синего берут 3,2 мл N раствора NaOH; для растворения 0,1 г бромкрезолпурпурного берут 3,7 мл N раствора NaOH. К полученному щелочному раствору добавляют 250 мл дистиллированной воды и получают 0,04%-ный раствор. Раствор хранят на холоде в сосудах из темного стекла с притертой пробкой. Бромтимоловый синий изменяет окраску в диапазоне рН 6,0-7,6; он является желтым в кислых средах и синим - в щелочных, давая салатно-зеленую окраску при рН 7,1. Бромкрезолпурпурный изменяет окраску в диапазоне рН 5,2-6,3; он делается бледно-желтым в кислых средах и красно-фиолетовым в нейтральных, давая зеленую с пурпурным оттенком окраску при рН 6,3. Для определения реакции среды на фарфоровую пластинку наносят 1 мл среды и каплю индикатора.

Колориметрическое определение рН производят также в компараторе по методу Михаэлиса.

Требуемую величину рН питательной среды устанавливают в небольшом объеме, добавляя к ней по каплям 0,5%-ный раствор едкого натра или 10%-ный раствор углекислого натрия. Вычисляют, какой объем раствора следует прибавить ко всему объему среды для достижения требуемой величины рН. После прибавления раствора и тщательного перемешивания снова проверяют реакцию среды.

1.2.22. Качество вновь приготовленных питательных сред проверяют путем параллельного посева одних и тех же проб продукта на новую среду и на среду, на которой до этого проводилась работа. Качество вновь приготовленной среды считают удовлетворительным, если при подсчете количество выросших на ней колоний оказывается близким к количеству, полученному при использовании контрольной среды (среды, на которой проводилась работа ранее).

Результаты контроля записывают в журнал по форме. Плотные питательные среды в холодильнике могут храниться до 3 месяцев, жидкие питательные среды - 10-14 дней.

Для проверки стерильности питательных сред их следует поставить в термостат при 37 °С на 48 ч. Если после этого на плотных питательных средах не обнаруживается колоний микроорганизмов, а в жидких средах нет помутнения среды или осадка, свидетельствующих о росте микроорганизмов, питательные среды считаются стерильными.

1.2.23. Раствор метиленового голубого. Для приготовления насыщенного спиртового раствора смешивают 10 г метиленового голубого со 100 мл 96%-ного этилового спирта. Смесь ставят в термостате при температуре 37 °С на 24 ч, а затем фильтруют в термостат при той же температуре. Получают насыщенный раствор метиленового голубого, который может храниться в хорошо укупоренной бутылке из темного стекла в течение 3 месяцев. Рабочий раствор метиленового голубого для редуктазной пробы готовят следующим образом: к 5 мл насыщенного спиртового раствора метиленового голубого (кристаллы, выпавшие в результате хранения насыщенного раствора растворяют в водяной бане при 45 °С в течение 5-10 мин) прибавляют 195 мл дистиллированной воды, смесь перемешивают.

Рабочий раствор метиленового голубого сохраняют в склянках из темного стекла до 7 суток. Насыщенный спиртовой раствор метиленового голубого сохраняется в склянках из темного стекла до 3 месяцев.

Раствор метиленового голубого для окрашивания препарата: к 30 мл насыщенного спиртового раствора прибавляют 100 мл 0,01%-ного водного раствора КОН.

1.2.24. Раствор резазурина (резазурина Na соль). Для приготовления основного раствора резазурина 100 мг резазурина растворяют в 200 мл прокипяченной и охлажденной дистиллированной воды, получают 0,05%-ный раствор резазурина. Срок хранения основного раствора резазурина не более 30 суток при температуре 8-10 °С. Основной раствор используется для определения бактериальной обсемененности сырых сливок.

Для определения бактериальной обсемененности сырого молока применяется рабочий раствор резазурина, который приготавливают из основного раствора разбавлением последнего прокипяченной и охлажденной дистиллированной водой в соотношении 1:2,5 (например, к 10 мл основного раствора прибавляют 25 мл воды).

Рабочий раствор содержит 0,014% резазурина. Срок хранения рабочего раствора резазурина не более 7 суток при температуре не выше 8-10 °С.

Резазурин, его основной и рабочий растворы хранят в банках, защищенных от света, или в банках из темного стекла.

1.2.25. Раствор сычужного фермента. 0,5 г сычужного порошка растворяют в 100 мл воды, прокипяченной и охлажденной до 30 °С.

1.2.26. Раствор лимоннокислого натрия. 2 г лимоннокислого натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды и стерилизуют при 121 °С в течение 15 мин.

Посевы производят в боксе (в помещении, приспособленном для проведения микробиологических исследований).

При отсутствии специального бокса допускается проведение анализов в лабораторной комнате, в которой во время анализа должны быть закрыты форточки и дверь во избежание движения воздуха.

Дезинфекцию помещений проводят протиранием всех поверхностей хлорными или другими дезинфицирующими препаратами по соответствующей для каждого препарата инструкции. За 2-3 ч до начала работы включают бактерицидные лампы (пребывание людей в помещении с включенными бактерицидными лампами запрещается).

1.4.1. Отбор проб молока и молочных продуктов для микробиологических исследований проводится в соответствии с ГОСТ 9225-68* и ГОСТ 3226-68 с регистрацией номера исследуемой партии в лабораторном журнале.
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 9225-84. Здесь и далее. - Примечание изготовителя базы данных.

При отборе проб для микробиологических исследований на предприятии работниками СЭС необходимо, чтобы микробиолог завода одновременно с ними отбирал пробы и исследовал их.

1.4.2. При отборе проб молока для определения редуктазы руководствуются основными понятиями и общими правилами отбора проб по ГОСТ 13928-68* "Молоко и сливки заготовляемые. Отбор проб и подготовка их к анализу".
______________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 13928-84. - Примечание изготовителя базы данных.

1.4.3. Отбор проб для определения редуктазы производят после отбраковки молока, не подлежащего приемке по кислотности согласно ГОСТ 13264-70 .

1.4.4. Отбор пробы молока производят пробником или черпаком в стерильную посуду с пробкой.

Примечание. Мутовку, черпак или пробник стерилизуют или обрабатывают путем хлорирования (200 мг активного хлора на 1 л воды).

1.4.5. Пробы для микробиологических исследований отдельных продуктов берут стерильным приспособлением в стерильную посуду* перед отбором проб для физико-химических исследований.
______________
* Перед отбором пробы для контроля мелкорасфасованной продукции (плавленый сыр, масло сливочное и др.) поверхность упаковки тщательно протирают ватой, смоченной спиртом.

Посуду с образцом закрывают стерильной ватной или притертой стеклянной пробкой и снабжают этикеткой, в которой указывают: номер образца; наименование и сорт продукта; номер и размер партии; день и час отбора образца; должность и подпись лица, отобравшего образец; номер стандарта, по которому изготовлен продукт.

1.4.6. Микробиологические исследования продукта производят тотчас же или не позднее 4 ч с момента отбора проб при температуре хранения не выше +6 °С.

1.4.7. Пробы для микробиологического анализа от отдельных продуктов отбирают следующим образом.

1.4.7.1. Молоко, сливки, кефир, сметана и другие подобные продукты. После тщательного перемешивания стерильным черпаком отбирают около 50 мл продукта в стерильную посуду. От расфасованных продуктов отбирают 1-2 образца в упаковке от партии (выборочно). Приготовление разведений производится согласно п.1.4.8. и 1.4.9.

1.4.7.2. Сыр. От проверяемой партии отбирается головка сыра. Поверхность сыра в том месте, откуда будет взята проба, прижигают (для удаления микрофлоры поверхностного слоя) нагретым ножом или шпателем. Стерильный щуп вводят наклонно в середину сыра на его длины. Из щупа от вынутого столбика сыра отбирают около 10 г его и помещают в стерильную посуду с притертой или ватной пробкой. Из разных мест столбика сыра вырезают кусочки и отвешивают на профламбированном часовом стекле 1 г.

Взятую навеску сыра тщательно растирают в профламбированной ступке, прикрытой стерильной крышкой от чашки Петри, постепенно добавляя 9 мл стерильного 2%-ного раствора лимоннокислого натрия или физиологического раствора, подогретого до 45 °С, и получают разведение в 10 раз (1-е разведение). Отсюда делают последующие разведения.

1.4.7.3. Плавленый сыр. От исследуемой партии отбирают 1-2 образца в упаковке. Пробу отбирают профламбированным ланцетом из разных мест сыра (включая поверхностный слой) около 10 г. Из отобранной пробы взвешивают на профламбированном часовом стекле 1 г плавленого сыра. Разведения готовят так же, как в п.1.4.7.2.

1.4.7.4. Масло. Пробу масла, расфасованного в крупную тару, отбирают стерильным щупом на расстоянии 3-5 см от края образца, направляя щуп к противоположной стороне и отпуская примерно на его длины. Из столбика масла отбирают стерильным шпателем около 20 г его и помещают в стерильную посуду. При отборе пробы масла из мелкой расфасовки берут около 20 г (включая поверхностый слой). Перед исследованием масло в посуде расплавляют в водяной бане, нагретой до 40-45 °С. Из расплавленного масла после тщательного перемешивания стерильной пипеткой берут 1 мл и вносят в пробирку с 9 мл стерильного физиологического раствора, подогретого до 40 °С. Из полученного таким образом разведения в 10 раз (1-е разведение) готовят все последующие разведения.

1.4.7.5. Творог, творожные изделия. При отборе проб из разной тары верхний слой продукта тщательно зачищают. Пробу отбирают способом, указанным для масла, в количестве 20 г. От расфасованных продуктов отбирают 1-2 образца в упаковке. Для микробиологического анализа отвешивают 10 г продукта на стерильном часовом стекле, чашке Петри и т.п. тщательно растирают его в стерильной ступке, прикрытой стерильной крышкой от чашки Петри. К приготовленной навеске (10 г) добавляют 90 мл стерильного физиологического раствора, подогретого до 40-45 °С, и получают разведение в 10 раз (1-е разведение). Отсюда делают последующие разведения.

1.4.7.6. Сгущенное молоко или сливки с сахаром, какао или кофе со сгущенным молоком и сахаром. От каждой партии отбирают по две банки с продуктом, в том числе одну банку до закатки, если образцы отбирают на заводе. Если продукция расфасована в бочки, фляги, цистерны, то образцы отбирают по 50 г из одной емкости от одной партии.

Банки с продуктом перед анализом тщательно моют и вытирают. Перед вскрытием крышку банки, пробку бочки и часть днища вокруг пробки фламбируют. Содержимое банки перемешивают и делают навеску 10 г продукта в колбу с 90 мл стерильного физиологического раствора, подогретого до 45 °С. Смесь тщательно перемешивают до полного растворения; получают разведение в 10 раз (1-е разведение). Отсюда делают последующие разведения.

1.4.7.7. Сухое молоко, сухие сливки с сахаром и без сахара и другие сухие молочные продукты. Из мешка или бочки стерильной ложкой отбирают из разных мест пробу продукта в количестве 50 г и помещают в стерильную сухую тару. Если продукция расфасована в банки или коробки, то от каждой партии отбирают 1-2 образца в оригинальной упаковке.

Затем отвешивают 10 г продукта на профламбированном часовом стекле или стерильном кусочке пергамента.

Взвешенную навеску высыпают в колбу с 90 мл стерильного физиологического раствора, подогретого до 45 °С, тщательно взбалтывают до полного растворения сухого молока. Таким образом получают разведения продукта в 10 раз (1-е разведение), откуда делают последующие разведения.

1.4.7.8. Сахар. Мука. Декстринмальтозная патока (для производства сухих молочных смесей "Малыш" и "Малютка"). Проба отбирается в сухую стерильную закрытую посуду из 10 мешков одной партии или четырех-пяти мест цистерны с декстринмальтозной патокой, всего около 100 г.

После перемешивания пробы помещают 10 г навески в колбу, содержащую 90 мл стерильного физиологического раствора, взбалтывают в течение 5 мин (а сахар до растворения). Отсюда делают посевы и последующие разведения для посевов.

1.4.8. Проведение нейтрализации образцов кисломолочных продуктов и заквасок. Нейтрализацию кисломолочных продуктов (кефир, простокваша, ряженка и ацидофильные продукты) и заквасок проводят до рН 6,8-7,0 перед посевом разведений продуктов в среду Кесслер. Для этого отбирают стерильной пипеткой 10 мл исследуемого продукта или закваски в стерильную пробирку или колбочку и добавляют 1 мл 10%-ного раствора питьевой соды.

Образцы творога, сметаны, сыра, кислосливочного масла нейтрализации не подлежат, т.к. при микробиологическом контроле указанные продукты засевают в больших разведениях (см. табл.9).

1.4.9. Для получения разведений молока, сливок и кисломолочных продуктов стерильной пипеткой берут 1 мл исследуемого продукта и вносят в пробирку с 9 мл стерильного физиологического раствора. Пипетку 2-3 раза промывают этим раствором. Таким образом получают разведение продукта в 10 раз (1-е разведение).

Для получения разведения исследуемого продукта в 100 раз (2-е разведение) новой пипеткой берут из 1-го разведения 1 мл и вносят в 9 мл стерильного физиологического раствора. Последующие разведения готовят таким же образом. При приготовлении разведений каждый раз применяют новую пипетку.

При посеве на чашки Петри посевной материал вносят от большего разведения к меньшему. В этом случае пользуются одной пипеткой.

1.4.10. Выбор разведений для посевов. Выбор разведений зависит от предполагаемой бактериальной обсемененности исследуемого материала.

В приложении 1 даны ориентировочные разведения для посева, которые выбраны на основании бактериальной обсемененности продуктов, выработанных в обычных санитарно-гигиенических условиях производства.

1.4.11. Время от момента приготовления разведений до посева не должно превышать 15-20 мин.

Контроль сырья и готовой продукции (определение общего количества бактерий, определение бактерий группы кишечной палочки, просмотр микроскопических препаратов) проводится по ГОСТ 9225-68. Негостированные методы используются для внутриведомственного контроля.

2.1.1. В процессе жизнедеятельности бактерии выделяют в окружающую среду, наряду с другими окислительно-восстановительными ферментами, анаэробные дегидразы, по старой классификации называемые редуктазами. Существует некоторый параллелизм между общим количеством бактерий в молоке и содержанием в нем редуктаз, что дает возможность использовать редуктазную пробу как косвенный показатель бактериальной обсемененности сырого молока.

2.1.2. Проба на редуктазу с применением метиленового голубого (органический краситель).

В пробирки (180х20 мм) наливают по 1 мл рабочего раствора метиленового голубого (п.1.2.23) и по 20 мл исследуемого молока, предварительно нагретого до 38-40 °С, закрывают резиновыми пробками, смешивают путем медленного трехкратного переворачивания пробирки. Пробирки помещают в редуктазник, водяную баню или термостат.

Вода должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше.

Температура воды в редуктазнике или в бане после погружения пробирок с молоком должна поддерживаться в течение всего времени определения в пределах 38-40 °С.

Момент погружения пробирок в баню считают началом анализа.

Наблюдение за изменением окраски ведут через 20 мин, через 2 ч, через 5 ч 30 мин после начала анализа. Окончанием анализа считается момент обесцвечивания окраски молока, при этом остающийся небольшой кольцеобразный окрашенный слой в верху (примерно 2 см) или небольшая окрашенная часть в низу пробирки в расчет не принимаются. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают.

В зависимости от времени обесцвечивания молоко относят к одному из четырех классов в соответствии с табл.1.

2.1.4. Проба на редуктазу с применением резазурина (для сырого молока).

В этой пробе для определения содержания в молоке редуктаз используют свойство резазурина быстро изменять свою окраску при восстановлении. Оценку качества молока при пробе с резазурином получают в течение 1 ч, а молоко с особо высокой бактериальной обсемененностью может быть выявлено через 20 мин.

В пробирки наливают по 1 мл рабочего раствора резазурина (см. п.1.2.24) и по 10 мл исследуемого молока, предварительно подогретого до 38-40 °С, закрывают резиновыми пробками, смешивают путем медленного трехкратного перемешивания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник или в водяную баню. Водяную баню с пробирками ставят в термостат.

Вода должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше.

Температура воды в редуктазнике или в бане после погружения пробирок с молоком должна поддерживаться в течение всего времени в пределах 38-40 °С.

Пробирки с молоком и резазурином на протяжении анализа должны быть защищены от прямых солнечных лучей.

Момент погружения пробирок в баню считают началом анализа. Показания снимают через 20 мин, через 1 ч, не встряхивая и не переворачивая пробирки. Молоко, обесцвечивающееся через 20 мин, относят к IV классу, и оно дальнейшему исследованию не подлежит. Пробирки с таким молоком удаляют из редуктазника. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают. Оставшиеся пробирки однократно переворачивают и оставляют в редуктазнике или водяной бане до конца анализа.

В зависимости от времени обесцвечивания и изменения окраски молоко относят к одному из четырех классов в соответствии с табл.3.

Молоко I и II классов пригодно для сыроделия, III класса не пригодно для сыроделия.

Готовят редуктазную пробу с метиленовым голубым (см. п.2.1.2; п.2.1.3) или с применением резазурина (см. п.2.1.4) и устанавливают время обесцвечивания и изменения окраски молока и его бактериальной обсемененности. При этом пробирки с молоком можно закрывать ватными пробками. Затем эти же пробирки оставляют на 24 ч при 38-40 °С. Осмотр пробирок через 24 ч, оценку качества молока и пригодность его для сыроделия производят в соответствии с п.2.2.2.

2.4.1. Проба применяется при определении пригодности молока для сыроделия.

В чисто вымытые, хорошо просушенные и ополоснутые 2-3 раза тем же молоком пробирки вместимостью 25-30 мл наливают молоко (приблизительно 20 мл). Пробирки закрывают ватными пробками и ставят в термостат, водяную баню или редуктазник при температуре 37-38 °С на 24 ч.

2.4.2. Через 24 ч после помещения пробирок в термостат (или в водяную баню) производят осмотр проб. На основании этого осмотра относят молоко к одному из четырех классов в соответствии с табл.6.

Сразу после заливки агара содержимое чашки следует тщательно перемешать путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала. После застывания агара чашки Петри перевертывают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат при температуре 37 °С на 48 ч.

2.5.2. После этого подсчитывают количество выросших колоний в каждой чашке. При этом для подсчета берут те чашки, количество колоний в которых не менее 50 и не более 300.

В отдельных случаях при большом числе колоний дно чашки Петри делят на 4-6 одинаковых секторов, подсчитывают число колоний в 2-3 противолежащих секторах, находят среднее арифметическое число колоний для них, которое умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом находят общее количество колоний, выросших на одной чашке.

Число колоний, выросших на каждой чашке, пересчитывают на 1 г или 1 мл продукта с учетом разведения. Окончательным результатом будет среднее арифметическое от результатов подсчета колоний в отдельных чашках.

2.6.1. Для характеристики санитарно-гигиенических условий производства и реализации продукции устанавливают степень обсеменения продуктов бактериями группы кишечной палочки, т.е. определяют бродильный или коли-титр. Бродильный титр означает наименьшее количество продукта, выраженное в граммах или миллилитрах, в котором обнаружены бактерии группы кишечной палочки, т.е. грамотрицательная палочка, разлагающая глюкозу на кислоту и газ при 43 °С в течение 24 ч (первая бродильная проба). Коли-титр означает наименьшее количество продукта, выраженное в граммах или миллилитрах, в котором обнаружены цитроотрицательные разновидности бактерий группы кишечной палочки (после идентификации).

2.6.2. Посев в среду Кесслер (первая бродильная проба) производят из разведений продуктов в объемах, указанных в табл.8. По 1 мл из выбранных разведений продукта засевают в пробирки со средой Кесслер. Пробирки с посевами помещают в термостат при температуре 43 °С на 18-24 ч. Затем пробирки с посевами просматривают и устанавливают бродильный титр (см. п.2.6.7).

Примечание. При внутризаводском микробиологическом контроле сырья, полуфабрикатов, готовой продукции допускается ограничивать исследование на наличие бактерий группы кишечной палочки определением только бродильного титра (по первой бродильной пробе).

При отсутствии газообразования через 18-24 ч продукт считают не загрязненным бактериями группы кишечной палочки.

2.6.3. При контроле продуктов, нормированных по содержанию кишечной палочки, из пробирок со средой Кесслер, в которых обнаружено газообразование, допускается проводить идентификацию кишечной палочки, если продукт имеет бродильный титр ниже 0,3 (см. примечание 2 приложения 1) и ниже 0,1 для сухого молока.

Из числа забродивших пробирок производят посев на среду Эндо с таким расчетом, чтобы получить отдельные колонии, для чего берут петлей минимальное количество посевного материала и производят посев частым штрихом. Перед посевом дно чашки со средой Эндо делят на четыре сектора. Посев из каждой пробирки со средой Кесслер производят на отдельный сектор. Чашки с посевами помещают (крышками вниз) в термостат с температурой 37 °С на 18-24 ч.

Примечание. Если газообразование обнаружено в пробирках с большим разведением и отсутствует в пробирках с предыдущим разведением, то на среду Эндо высевают из всех пробирок с предыдущим разведением.

При отсутствии на среде Эндо колоний, типичных для бактерий группы кишечной палочки (красных, нередко с металлическим блеском, розовых, бледно-розовых), продукт считают не загрязненным кишечной палочкой. При наличии на среде Эндо колоний, типичных для бактерий группы кишечной палочки, а также бесцветных, проводят их изучение.

При систематическом обнаружении бесцветных колоний на чашках с агаром Эндо в условиях работы лабораторий, расположенных на территории молочных предприятий, во избежание пропуска патогенных бактерий кишечной группы, указанные чашки должны передаваться в лаборатории санитарно-эпидемиологических станций для дальнейшего изучения.

2.6.4. Из изолированных колоний, характерных для бактерий группы кишечной палочки, делают препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Для приготовления препарата на чистое и охлажденное после фламбирования предметное стекло наносят петлей каплю дистиллированной воды, в которую вносят петлей небольшое количество агаровой культуры, не размешивая в воде. При приготовлении препарата из жидкой культуры на стекло наносят каплю ее. Затем вносят также петлей каплю реактива 1 (см. п.1.2.16). Смесь распределяют на участке примерно в 1 см, подсушивают при комнатной температуре и фиксируют, проводя предметное стекло один раз через пламя горелки. На одном стекле можно готовить по 6-8 мазков, отделяя их один от другого линиями, проведенными с лицевой стороны стекла. Препарат ополаскивают водой и тщательно просушивают фильтровальной бумагой.

После просушивания на препарат наносят с избытком реактив 2 так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность стекла. Продолжительность окрашивания - 0,5-1 мин. После окрашивания препарат быстро ополаскивают проточной водой, направляя струю под углом на стекло, помещенное вертикально. Препарат высушивают фильтровальной бумагой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Микробы, красящиеся по Граму (грамположительные), имеют темно-фиолетовый цвет, микробы, не красящиеся по Граму (грамотрицательные), имеют красный цвет.

Бактерии группы кишечной палочки - короткие грамотрицательные палочки.

2.6.5. Из одной проверенной колонии грамотрицательных палочек с каждого сектора Эндо производят высев петлей на среду Козера. Пробирки с посевами помещают в термостат при температуре 37 °С на 18-24 ч.

2.6.6. Отсутствие роста на цитратной среде Козера указывает на присутствие цитроотрицательных разновидностей бактерий группы кишечной палочки.

Изменение оливково-зеленого цвета среды Козера на васильковый свидетельствует о том, что обнаруженные бактерии кишечной палочки относятся к цитратположительным разновидностям, которые не учитывают.

В результате идентификации учитывают все разновидности кишечной палочки, не окрашивающиеся по Граму и вызывающие брожение с образованием кислоты и газа на среде Кесслер при 43 °С, не учитывают разновидности, дающие рост на цитратной среде Козера.

2.6.7. Вычисление коли-титра*.
______________
* Бродильный титр рассчитывается таким же образом по результатам первой бродильной пробы.

2.6.7.1. Молоко и сливки пастеризованные, кефир, ацидофильное молоко, простокваша, ацидофильно-дрожжевое молоко, кисломолочный напиток "Южный" и другие кисломолочные продукты, сливки сгущенные с сахаром (см. табл.9):

а) если ни в одном из засеянных объемов продукта кишечной палочки не обнаружено, то считают коли-титр более 3,0 мл;

б) если в одном из трех засеянных объемов по 1 мл продукта обнаружена кишечная палочка, считают коли-титр 3,0 мл;

в) если кишечная палочка обнаружена в посевах пяти или всех объемов продукта, то считают коли-титр менее 0,3 мл;

во всех остальных случаях считают коли-титр 0,3 мл.

2.7.1. В пробирку с расплавленной и охлажденной до 45-50 °С плотной средой Кесслер вносят стерильной или прокипяченной пипеткой 1 мл закваски (см. п.3.2.3) или 1 мл разведения продукта; а при взятии смыва - весь смывной раствор вместе с тампоном. Затем путем встряхивания пробирки хорошо размешивают среду с внесенным посевным материалом, дают ей застыть, после чего пробирку помещают в термостат или водяную баню с температурой 37-40 °С на 18-24 ч.

2.7.2. В случае наличия небольшого количества бактерий группы кишечной палочки в плотной среде Кесслер появляются трещины, при большом количестве этих бактерий в среде образуются пузырьки газа и агар разрывается.

2.8.1. Молоко исследуют непосредственно (без разведения) и после предварительного разведения в физиологическом растворе в соответствии с рекомендациями ГОСТ 9225-68 "Методы микробиологического исследования", а также в соответствии с приложением 1.

Кисломолочные продукты исследуют после нейтрализации, предусмотренной п.1.4.8, а также после разведения в физиологическом растворе, так как кислота препятствует выявлению бактерий группы кишечной палочки на индикаторных бумажках.

Масло также исследуют после разведения, так как жир препятствует полному выявлению кишечных палочек.

При использовании индикаторных бумажек для проверки качества мойки оборудования смывы берут стерильными увлажненными ватными или марлевыми тампонами, закрепленными на проволоке. В пробирки разливают по 10 мл физиологического раствора.

2.8.2. Индикаторные бумажки (в полиэтиленовых пакетах) хранят в бумажных пакетах из светонепроницаемой бумаги, а при работе предохраняют от действия солнечного света.

Индикаторные бумажки должны иметь белый или слегка кремовый цвет. Розовый цвет бумажек указывает на их засвеченность. Такие бумажки для употребления не пригодны.

Перед употреблением вынимают полиэтиленовый пакет с индикаторной бумажкой из бумажного пакета и с одной стороны разрезают профламбированными ножницами полиэтиленовый пакет.

Индикаторную бумажку вынимают из пакета, взяв пинцетом за перфорированный конец.

Индикаторную бумажку смачивают в исследуемом молоке, смыве с оборудования или в разведении молока и молочных продуктов путем однократного погружения, которое длится 3 с. Излишек влаги удаляют путем прикосновения конца бумажки к стенке сосуда или пробирки.

При такой обработке бумажка впитывает 0,5 мл жидкости.

Затем индикаторную бумажку вновь помещают в полиэтиленовый пакет, перфорированный конец бумажки удаляют. После вкладывания бумажки в пакет следует тщательно прогладить его, чтобы полиэтиленовая пленка с обеих сторон плотно прилегала к смоченной бумажке, и весь воздух был удален из пакета.

Разрезанный конец пакета зажимают между двумя пластинками и запаивают на пламени горелки.

Индикаторную бумажку (в полиэтиленовом пакете) помещают в термостат при температуре 43 °С на 12-18 ч.

Индикаторные бумажки в термостате должны находиться в строго горизонтальном положении, чтобы не имело место стекание жидкости.

2.8.3. После выдержки производят подсчет красных пятен на обеих сторонах бумажки.

Примечание: Если невозможно провести учет бактерий группы кишечной палочки сразу по извлечении индикаторной бумажки из термостата, их можно сохранять в холодильнике (4-6 °С) до следующего дня.

Содержание бактерий группы кишечной палочки в молоке и молочных продуктах (в 1 мл или 1 г) определяют умножением количества подсчитанных пятен на соответствующее разведение и удваиванием полученного результата. Кишечная палочка в смывах с оборудования должна отсутствовать.

2.8.4. Этот наиболее ускоренный метод выявления бактерий группы кишечной палочки можно использовать для внутризаводского контроля технологического процесса производства молока и различных молочных продуктов, для повседневного санитарно-гигиенического контроля оборудования, а также для внутризаводского контроля готовой продукции по содержанию бактерий группы кишечной палочки.

Соотношение между бродильным титром и количеством бактерий группы кишечной палочки, определяемым с помощью индикаторных бумажек, приводится ниже:

2.9.1. Наличие в молоке маслянокислых бактерий можно определить следующим образом:

10 мл исследуемого молока с кусочком (1-1,5 г) парафина в пробирке (пробирки с парафином должны быть стерильными) нагревают в водяной бане до 85-90 °С и выдерживают при этой температуре в течение 10 мин и затем выдерживают в термостате при 30 °С в течение 3 суток.

2.9.2. Для определения количества маслянокислых бактерий в молоке и сыре высевают различные разведения исследуемого материала (по 1 мл) в пробирки со средой (см. п.1.2.17), после посева пробирки нагревают в водяной бане до 85-90 °С и выдерживают при этой температуре в течение 10 мин, а затем выдерживают в термостате при 30 °С в течение 3 суток. Наличие маслянокислых бактерий в посевах определяют по образованию газа, запаху масляной кислоты.

2.9.3. Обнаружение спор маслянокислых бактерий с применением среды СДА (п.1.2.18). Разведения материала, выбранного для посева, нагревают до 85 °С и выдерживают при этой температуре в течение 10 мин для уничтожения вегетативных клеток.

Посев производится в среду для анаэробов (СДА). 1 мл посевного материала вносят на дно пробирки со средой без перемешивания. Каждое разведение засевают минимум в две пробирки. При посеве исследуемого материала в жидкую среду не требуется никакой защиты ее от воздуха. При посеве его на плотную питательную среду в пробирки после затвердевания питательной среды сверху заливают слой водного агара высотой 1,5-2 см для того, чтобы анаэробы развивались во всей массе.

Посевы выдерживают при 30 °С в течение 3 суток. Рост маслянокислых бактерий определяется по сильному газообразованию и запаху масляной кислоты.

2.10.1. Для определения количества протеолитических бактерий производят посев по 1 мл каждого из выбранных разведений на чашки Петри и заливают молочным агаром. Чашки Петри с посевами выдерживают в термостате при 30 °С в течение 48 ч и после этого подсчитывают число выросших колоний протеолитических бактерий (п.2.5.2).

2.10.2. Протеолитические бактерии определяют на данной среде по зонам просветления, образующимся вокруг них в результате разложения белка под действием протеолитических ферментов.

На дно подогретой чашки Петри наливают стерильный расплавленный говяжий жир и сразу сливают. На дне остается тонкий слой застывшего жира.

Для определения количества липолитических бактерий в масле производят посев по 1 мл каждого из выбранных разведений на чашки Петри с последующей заливкой посевов расплавленным и остуженным до 40-45 °С питательным агаром (п.1.2.20).

Чашки Петри с посевным материалом выдерживают в течение 5-6 суток при комнатной температуре (20-23 °С). После этого подсчитывают число выросших колоний.

Колонии липолитических бактерий, разлагающих жир, образуют белые зоны.

Анализ производят посевом выбранных разведений исследуемого материала в чашки Петри с сусловым агаром (с картофельно-глюкозным агаром или средой Сабуро).

Чашки выдерживают при комнатной температуре (20-23 °С) в течение 3-5 суток. Подсчитывают отдельно колонии дрожжей и плесеней.

Этот метод может быть использован для быстрого определения прогноза стойкости пастеризованного молока.

В пробирки наливают по 1 мл рабочего раствора резазурина (см. п.1.2.24) и по 10 мл пастеризованного молока, отобранного из бутылок или пакетов после разливочно-укупорочного автомата, закрывают резиновыми пробками, смешивают путем трехкратного перемешивания.

Пробирки помещают в редуктазник или водяную баню.

Температура воды в редуктазнике или водяной бане после погружения пробирок с молоком должна поддерживаться в течение всего времени в пределах 38-40 °С.

Момент погружения пробирок в баню считают началом анализа. Показания снимают через 1 ч. Оценку результатов проводят на основании шкалы прогноза стойкости пастеризованного молока (табл.12).

2.14.1. При контроле состава микрофлоры заквасок микроскопируют препараты, окрашенные метиленовым голубым. Для приготовления препаратов на чистое предметное стекло наносят петлей небольшую каплю исследуемого материала и распределяют на площади около 1 см . При исследовании творога и творожных изделий на стекло наносят каплю воды петлей, вводят в нее петлей немного продукта, тщательно перемешивают и распределяют на площади около 1 см . Препарат высушивают при комнатной температуре, фиксируют на пламени горелки и красят метиленовым голубым.

Оценку качества закваски производят по микроскопическому препарату:

в закваске для творога, сметаны и простокваши, сыра и масла должны обнаруживаться только молочнокислые стрептококки, расположенные равномерно в поле зрения микроскопа;

в закваске для сыра домашнего должны обнаруживаться отдельные диплококки и цепочки, расположенные равномерно в поле зрения микроскопа;

в закваске для ряженки (простокваши украинской), варенца - только молочнокислые стрептококки в виде диплококков и цепочек, при добавлении болгарской палочки - небольшое количество палочек, для простокваши мечниковской - молочнокислые стрептококки и болгарская палочка в соотношении 10:1 -15:1;

для простокваши южной - молочнокислые стрептококки и болгарская палочка в соотношении 3:1-10:1;

для ацидофильного молока и пасты - ацидофильная палочка;

для ацидофильной простокваши - молочнокислые стрептококки и ацидофильная палочка в соотношении 1:1;

для ацидофильно-дрожжевого молока - ацидофильные палочки и единичные клетки дрожжей (2-5 клеток в поле зрения микроскопа);

для кефира (грибковая) - преобладание молочнокислых стрептококков, единичные клетки палочек и дрожжей; иногда скопления палочек и дрожжей; (производственная) - преобладание молочнокислых стрептококков, единичные клетки палочек и дрожжей;

для кумыса - незернистые палочки, клетки дрожжей - 3-25 в поле зрения.

2.14.2. Контроль микроскопических препаратов закваски должен сопровождаться определением ее кислотности (°Т). Кислотность заквасок должна соответствовать требованиям инструкции по их приготовлению.

2.15.1. Для более тщательной проверки чистоты закваски из нее готовят разведения в стерильном физиологическом растворе. Составляют ряд из 4-5 пробирок со стерильным молоком. В первую пробирку засевают 1 мл закваски без разведения, во вторую - 1 мл первого разведения и т.д.

2.15.2. Посевы закваски, содержащей стрептококки, выдерживают при 40-45 °С (для выявления посторонних молочнокислых палочек); закваски, содержащие палочки, - при 30-35 °С (для выявления посторонних молочнокислых стрептококков) в течение 3 суток. Полученные сгустки микроскопируют и устанавливают наличие или отсутствие в них посторонних микроорганизмов.

2.15.3. Использование этого метода дает возможность установить наличие в закваске посторонней микрофлоры в количестве менее десятков тысяч в 1 мл, которое нельзя обнаружить методом непосредственного микроскопирования.

Посторонняя микрофлора не должна обнаруживаться при посеве 1 мл закваски.

После пастеризации молока асептически отбирают небольшую пробу (10-20 мл) и помещают ее в стерильную пробирку или банку. Пробу выдерживают 24-48 ч при 40-45 °С, после этого отмечают характер полученного сгустка в пробирке и просматривают его микроскопический препарат. Если пастеризация была проведена при температуре ниже 90 °С, сгусток получается более или менее плотным и под микроскопом обнаруживают в большом количестве стрептококки. Если пастеризация проведена при 90-95 °С, но при недостаточной выдержке или без эффективного перемешивания, сгусток в пробирках может быть слабым, микроскопированием выявляют в препаратах зернистые или незернистые палочки. При установлении в молоке пептонизации (наличие зоны просветления в верхнем слое), а при микроскопировании - споровых палочек можно сделать заключение о правильно проведенной пастеризации (температура 90-95 °С с выдержкой 10-30 мин).

Стерильным тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором, протирают исследуемый участок оборудования. Тампон опускают в пробирку со стерильным молоком и выдерживают 16-24 ч при 40-45 °С (для выявления палочек) или при 30 °С (для выявления дрожжей). После выдержки просматривают микроскопические препараты из молока и устанавливают наличие молочнокислых палочек или дрожжей.

2.18.1. Основными причинами нарушения процесса сквашивания является наличие в молоке антибиотиков или бактериофага.

Для получения приблизительного представления о причинах несквашивания наблюдают за развитием молочнокислых стрептококков в молоке в первые часы после внесения закваски. Если молоко содержит антибиотики, развитие микроорганизмов закваски не наблюдается с самого момента заквашивания, если же причиной несквашивания является развитие бактериофага, то сначала наблюдается увеличение количества клеток, а через 2-3 ч - их исчезновение в результате лизиса.

2.18.2. Определение ингибирующих веществ (антибиотиков, нейтрализующих и консервирующих веществ). Для установления наличия ингибирующих веществ в молоке в пробирки наливают по 10 мл исследуемого молока и прогревают в водяной бане в течение 10 мин при температуре 85-95 °С. После прогревания пробирки охлаждают водопроводной водой до температуры 42 °С и вносят культуру термофильного стрептококка в количестве 0,3 мл. Пробирки с внесенной культурой тщательно перемешивают и помещают в редуктазник или термостат при температуре 42-43 °С и выдерживают в течение 2 ч.

Затем в пробирки добавляют по 1 мл 0,05%-ного раствора резазурина, приготовленного на прокипяченной и охлажденной дистиллированной воде, и содержимое пробирок тщательно перемешивают. После добавления резазурина пробирки ставят в редуктазник или термостат еще на 15 мин при температуре 42-43 °С, затем учитывают результат. Пробирки с молоком, не содержащие ингибирующих веществ, имеют ярко-розовый или белый цвет. Молоко, содержащее ингибирующие вещества, имеет сине-фиолетовую окраску.

Для определения ингибирующих веществ в молоке используют закваску, состоящую из термофильного стрептококка*.
______________
* Используется сухая закваска с маркировкой "Для определения ингибирующих веществ".

При культивировании закваски из термофильного стрептококка обезжиренное молоко разливают по 10-12 мл в пробирки и стерилизуют при 1 ати в течение 10 мин. В стерилизованное молоко с температурой 43-45 °С вносят стерильной пипеткой каплю культуры или одну петлю. Заквашенное молоко помещают в термостат при 42-43 °С и выдерживают до образования сгустка. Готовую закваску немедленно ставят на холод и хранят при температуре 3-5 °С не более 6-7 дней.

В специальном журнале микробиологом фиксируется качество закваски, используемой только для определения ингибирующих веществ. Отмечается время приготовления закваски, длительность и температура хранения ее. Раствор резазурина готовят по прописи приготовления раствора по п.1.2.24.

2.18.3. Установление причин снижения активности закваски при производстве сыра. Для установления причин снижения активности закваски рекомендуется следующий метод. Берут три колбы. В первую наливают молоко, пригодность которого для приготовления заквасок гарантирована или проверена заранее, а две другие - сборное молоко из сырной ванны. В каждую колбу со 150 мл молока наливают 5% рабочего раствора метиленового голубого, приготовленного так же, как при пробе на редуктазу; молоко пастеризуют при 76-80 °С в течение 10 мин. После этого молоко охлаждают до 30 °С, вносят в него 5% материнской закваски, и колбы встряхивают. Первая колба является контролем; во вторую добавляют 1% прокипяченной в течение 3-5 мин производственной закваски; в третью колбу - 1% производственной некипяченой закваски.

Колбы ставят в термостат при 30 °С. За посевами наблюдают через 4,5; 7,5 ч. Если в первой и второй колбах метиленовый голубой обеспечивается за 1,5-2 ч, а через 6-7 ч образуется сгусток, а в третьей колбе окраска исчезла через 1,5-2 ч, а через 7-7,5 ч вновь появилась, производственная закваска заражена фагом.

Для подтверждения достоверности обнаружения бактериофага в закваске рекомендуется также вести контроль за ходом молочнокислого процесса по понижению величины рН молока, которую определяют через 6, 9, 16 и 23 ч культивирования. Снижение скорости нарастания кислотности во второй и третьей колбах по сравнению с контролем говорит о низком качестве сборного молока как среды для развития молочнокислых бактерий. Если же кислотность молока в первой и второй колбах нарастает одинаково, а в третьей - более медленно, то это означает загрязнение производственной закваски фагом. Если наблюдается медленное нарастание кислотности и запаздывание образования сгустка во всех колбах, то это означает низкую активность закваски, что, по всей вероятности, связано с нарушением правил ее приготовления.

2.19.1. Оборудование, трубопроводы и инвентарь. Оборудование, не используемое после мойки и дезинфекции более 6 ч, вторично дезинфицируется перед началом работы. Контроль качества мойки и дезинфекции трубопроводов, оборудования и инвентаря осуществляется непосредственно перед началом их работы.

Смывы берут стерильными увлажненными ватными или марлевыми тампонами, закрепленными на проволоке (см. п.1.1.3).

Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажняют наклонением пробирки или опусканием тампона вниз. Смывы с крупного оборудования и инвентаря берутся с поверхности приблизительно 100 см . После взятия смыва пробку с тампоном вновь вставляют в пробирку так, чтобы тампон погрузился в физиологический раствор. Затем весь физиологический раствор вместе с тампоном засевают в 5 мл среды Кесслер. В случае необходимости проводят посев 1 мл смыва на общее количество бактерий, а оставшееся количество засевают в 5 мл среды Кесслер. Посевы выдерживают в термостате при 43 °С в течение 18-24 ч.

Бактерии группы кишечной палочки в смывах должны отсутствовать.

2.19.1.1. Весы, подогреватели, вакуум-кристаллизаторы, молокоочистители, сепараторы, маслообразователи, сырные формы, ванны, танки, баки, котлы, молочные цистерны - автомобильные и железнодорожные, холодильники открытого типа, аппаратура и оборудование с достаточно открытой внутренней поверхностью.

Площадь около 100 см протирают смоченным в стерильном физиологическом растворе тампоном, закрепленном на проволоке (см. п.1.3.3) или в обожженном пинцете.

Смыв делают со дна, боковой поверхности, со стенки около крана, с рабочей поверхности крышки и мешалки, если они имеются. В танках больших емкостей, где взятие пробы с задних и верхних стенок из люка рукой невозможно, смывы делают при помощи пинцета, насаженного на длинный металлический стержень. Стержень состоит из полых трубок, насаживаемых одна на другую, что позволяет получить любую его длину. Смывы с удаленных мест танков также берут с поверхности площадью около 100 см .

Особое внимание необходимо уделять контролю периодичности мойки танков, поскольку они являются основным источником вторичного обсеменения пастеризованного молока. Мойка танка должна производиться после каждого опорожнения его. Для контроля периодичности мойки танков по соответствующим журналам устанавливают количество моек и заполнения танка (выборочно, за сутки). По соотношению количества моек и заполнений определяют периодичность мойки танка.

Количество моек за сутки - 3

Количество заполнений за сутки - 5

Следовательно, за сутки было 1-2 заполнения невымытого танка.

2.19.1.2. Разливочно-укупорочные автоматы. Снимают крышку резервуара и отбирают пробы со стенки резервуара и с цилиндра, крана, воздушной трубки, резинового манжета (со всей внутренней поверхности).

2.19.1.3. Трубопроводы. Качество мойки труб и шлангов определяют анализом смыва со 100 см внутренней поверхности трубы, разбирая собранный для работы трубопровод в намеченном для исследования месте. Для того чтобы взять мазок с поверхности 100 см в трубе диаметром 50 мм, вводят стерильный, смоченный физиологическим раствором тампон внутрь трубы на 6,5 см, а при диаметре 36 мм - на 9 см. После ввода тампона в трубу на требуемую глубину его продвигают к выходу, делая вращательные движения.

2.19.1.4. Бутылки, банки. Для контроля чистоты мойки бутылок или банок берут 20 мл стерильного физиологического раствора. Для анализа отбирают с конвейера бутыломоечной машины 10 бутылок или банок. В первую бутылку вливают 20 мл стерильного физиологического раствора. Бутылку держат над горелкой под углом 45°, чтобы не попала микрофлора из воздуха. Поворотом бутылки (банки) смачивается раствором вся внутренняя поверхность ее, и смывной раствор сливается в следующую бутылку. Таким образом одной порцией стерильного физиологического раствора обрабатывают все 10 бутылок или банок. Из последней бутылки раствор выливают обратно в колбу или бутылку, в которой был стерильный физиологический раствор. 1 мл смывной жидкости засевается в чашку Петри для определения общего количества бактерий, а остальная смывная жидкость засевается в пробирку со средой Кесслер (5 мл).

2.19.1.5. Вакуум-аппараты. При контроле чистоты мойки оборудования вакуум-аппарата смывы берут с трубок калоризаторов и с внутренних стенок сепаратора.

Смывы со стенок сепаратора берут через отверстия люка, с трубок калоризатора - после открытия крышки. С внутренней части десяти трубок калоризатора смывы берут специальным, приготовленным для этой цели длинным пинцетом или металлическим стержнем; на пинцет или металлический стержень навертывают кусочек стерильной ваты или марли, смоченной в физиологическом растворе из колбы с 30 мл физиологического раствора. На стержне делают отметку на расстоянии 10 см от конца. Ватой или марлей протирают трубку калоризатора на глубине 10 см. Расчет количества микроорганизмов производят на 100 см внутренней поверхности трубы.

С внутренних стенок вакуум-аппарата смыв берут также металлическим стержнем со стерильной ватой на конце его с поверхности, приблизительно равной 100 см .

Допускается определять качество мойки вакуум-аппарата путем исследования конденсата, собранного из крана выхода сгущенного молока после пропаривания вакуум-аппарата.

Проводят посев 1 мл смыва или конденсата на общее количество бактерий и 1 мл засевают в 5 мл среды Кесслер.

2.19.1.6. Фляги, бидоны, ушаты. Контроль чистоты мойки можно проводить методом мазков с определенной поверхности (дно, стенка, крышка) (см. п.2.19.1).

Анализы по ходу технологического процесса фляжного молока показывают, что наибольшее обсеменение молока происходит от неудовлетворительно вымытых фляг. Поэтому на контроль мойки фляг необходимо обращать особое внимание. При этом наиболее тщательно нужно следить за дезинфекцией фляг, которая часто бывает недостаточной.

2.19.1.7. Цеховой инвентарь (мешалки, мутовки, лотки и т.д.). Для оценки мойки цехового молочного инвентаря пробы отбирают в тот момент, когда инвентарь подготовлен к работе. Качество мойки инвентаря оценивают по наличию брожения в жидкой среде Кесслер.

Смыв берут ватным марлевым тампоном с поверхности приблизительно 100 см , тампон со взятым материалом помещают в 5 мл среды Кесслер; при контроле качества мойки тазиков мазки берут с поверхности угла, стенки и дна в отдельности.

2.19.1.8. Деревянная тара. Для проверки качества мойки тары (бочки, кадки, ящики) пробы отбирают в тот момент, когда мойка закончена и тара подготовлена к использованию. Пробу берут ватным или марлевым тампоном с поверхности (приблизительно 100 см ) стенки, дна и угла (отдельно) и помещают в 5 мл среды Кесслер.

2.19.2. Руки работников. Анализ чистоты рук производят (без предварительного предупреждения) перед началом производственного процесса, после пользования туалетом только у тех работников, которые непосредственно соприкасаются с чистым оборудованием или продукцией.

Для взятия смывов с рук рабочих пользуются также марлевым или ватным тампоном. Перед анализом пробирку наклоняют, тампон смачивают стерильным физиологическим раствором, вынимают вместе с ватной пробкой и тщательно обтирают им обе руки и пальцы каждого рабочего. Пробу с тампоном вновь вставляют в пробирку так, чтобы тампон погрузился в физиологический раствор. Затем весь физиологический раствор вместе с тампоном из пробирки засевают в 5 мл среды Кесслер. Посевы выдерживают при 43 °С в течение 18-24 ч.

Контроль хлорирования рук.

Отдельные участки рук протирают ватным тампоном, смоченным йодкрахмальным раствором, который готовят, смешивая в равных соотношениях 6%-ный раствор KJ и 4%-ный раствор растворимого крахмала (4 г растворимого крахмала и 96 мл дистиллированной воды перемешивают, доводят до кипения и охлаждают до 20 °С).

Такую пробу производят в 2-3 местах рук. Если на тампоне и поверхности рук в местах соприкосновения с тампоном появляется сине-бурое окрашивание, это свидетельствует о наличии ионов хлора, т.е. руки были обработаны раствором хлорной извести. Следы окрашивания удаляют тампоном, смоченным 3%-ным раствором гипосульфита натрия.

2.19.3. Воздух. При проведении анализа открытые чашки Петри с мясо-пептонным агаром (для определения общего количества бактерий), со средой Сабуро, с картофельно-глюкозным или сусловым агаром (для определения количества дрожжей и плесеней) размещают во время работы в производственных помещениях.

Чашки выдерживают 5 мин, затем закрывают и производят анализ по указанным методикам (п.2.5.1 [2-й абзац], 2.5.2).

Оценка результатов производится по микробиологическим показателям, предусмотренным в приложении 7.

2.19.4. Вода. Отбор проб воды, хранение и транспортировка их производятся по ГОСТ 18963-73 .

Исследование воды производится по ГОСТ 18963-73 .

2.19.5. Материалы производства.

2.19.5.1. Пергамент, кашированная фольга, пленка для упаковки сыра, фольга-полиэтилен для упаковки сухих молочных смесей, комбинированные материалы для упаковки молока и молочных продуктов (тетра-пак, тетра-брик и др.).

Для определения чистоты материалов разворачивают исследуемый рулон и с внутренней поверхности берут смыв стерильным ватным или марлевым тампоном со 100 см . Затем тампон помещают в пробирку с 3-4 мл стерильного физиологического раствора, чтобы тампон погрузился в физиологический раствор. 1 мл смыва засевают в стерильную чашку Петри и заливают мясо-пептонным агаром для определения общего количества бактерий, остальной смыв вместе с тампоном засевается в пробирку с 5 мл среды Кесслер для определения присутствия бактерий группы кишечной палочки. Оценка результатов производства по микробиологическим показателям, предусмотренным в приложении 6.

2.19.5.2. Клепка. Определение загрязненности клепки производится по методикам, указанным в п.2.19.5.1.

2.19.5.3. Соль. Соль в количестве 5 г растворяют в 95 мл стерильного физиологического раствора. Из этого раствора делают посев 1 мл для определения общего количества бактерий. Микробиологические показатели для оценки результатов представлены в приложении 6.

2.19.5.4. Сахар. Сахар, поступающий на производство, очень часто содержит дрожжи, которые способны вызвать брожение и, следовательно, порчу продукта. Для анализа навеску в 10 г помещают в 90 мл стерильного физиологического раствора. Из этого разведения делают посев 1 мл в стерильную чашку Петри и заливают сусловым агаром. При контроле сахара, применяемого при производстве сухих молочных смесей "Малыш" и "Малютка", определяют также общее количество бактерий и бродильный титр. Микробиологические показатели оценки результатов представлены в приложении 6.

2.19.5.5. Сычужный порошок или пепсин. Сычужный порошок или пепсин исследуют на общее количество бактерий и на присутствие бактерий группы кишечной палочки.

При учете общего количества бактерий в сычужном порошке или пепсине берут навеску порошка в 1 г и помещают ее в 99 мл стерильного физиологического раствора. 1 мл данного разведения высевают на чашки Петри и заливают расплавленным и остуженным мясо-пептонным агаром*.
______________
* Во избежание возможных ошибок при подсчете колоний за счет нерастворившихся частиц сычужного порошка чашки Петри просматривают сразу же после застывания агара и фиксируют нерастворившиеся частицы.

Для определения наличия бактерий группы кишечной палочки 3 г сычужного порошка или пепсина засевают в пробирки со средой Кесслер.

Согласно ОСТ 4978-75 "Сычужный порошок" в нем предусматривается бактериальная обсемененность не более 8000 клеток в 1 г, коли-титр не ниже 3,0. По ОСТ 4953-75 "Пепсин пищевой" бактериальная обсемененность его не более 10000 клеток в 1 г, коли-титр не ниже 3,0.

2.19.5.6. Мука, декстрин-мальтозная патока (для производства сухих молочных смесей "Малыш" и "Малютка"). Для анализа навеску в 10 г помещают в 90 мл стерильного физиологического раствора. Из этого разведения делают посев 1 мл на сусловый агар для определения дрожжей и плесеней и посев 1 мл в среду Кесслер для определения бродильного титра.

Из второго и третьего разведений делают посев 1 мл на общее количество бактерий.

Сырое молоко или сливки, поступившие на завод, исследуют по редуктазной пробе; в пастеризованных сливках определяют бродильный титр. Редуктазную пробу с метиленовым голубым или резазурином в молоке производит лаборант предприятия один раз в декаду по средней пробе молока каждого поставщика от любой сдачи.

3.2.1. Редуктазную пробу в молоке, применяемом для приготовления заквасок, производят лаборант или микробиолог 2-3 раза в неделю.

Молоко, направляемое на закваски, должно соответствовать требованиям первого класса по редуктазной пробе.

3.2.2. Качество закваски ежедневно проверяют, определяя активность (время сквашивания, кислотность), наличие посторонней микрофлоры путем просмотра микроскопического препарата в 10 полях зрения микроскопа (приложение 16), качество сгустка, вкус и запах.

Определение наличия ацетоина+диацетила и углекислоты в заквасках для масла и сыра производят в соответствии со специальной инструкцией по приготовлению заквасок.

Для проверки активности закваски производят пробное сквашивание ею молока в лабораторных условиях при термическом режиме, соответствующем цеховому.

Чистоту закваски, а также соотношение между компонентами закваски (например, между молочнокислыми стрептококками и палочками) проверяют ежедневно непосредственным микроскопированием препаратов.

Если на заводе нет микроскопа, образцы заквасок или микроскопические препараты посылают для контроля в областную контрольно-производственную лабораторию не реже 2 раз в месяц.

3.2.3. Наличие бактерий группы кишечной палочки устанавливают путем посева в среду Кесслер (см. табл.9). Анализ на наличие бактерий группы кишечной палочки производят из каждой закваски ежедневно. Бактерии группы кишечной палочки должны отсутствовать при посеве 3 мл закваски для кефира и 10 мл закваски для остальных продуктов.

3.2.4. В случае, если возникает сомнение в микробиологической чистоте заквасок, а при микроскопировании окрашенных препаратов посторонней микрофлоры обнаружить не удается, из заквасок делают посев разведений закваски в стерильное молоко (4-5 первых разведений), термостатируют с последующим просмотром микроскопических препаратов (п.2.15).

Эффективность пастеризации молока для заквасок проверяют в тех случаях, когда в заквасках микроскопированием или с помощью посевов обнаружены посторонние молочнокислые палочки (см. п.2.16).

3.3.1. В питьевом молоке и сливках выборочно от одной-двух партий не реже одного раза в 5 дней определяют общее количество бактерий и титр кишечной палочки*. По микробиологическим показателям питьевое молоко должно соответствовать требованиям ГОСТ 13277-67, а сливки пастеризованные - ОСТ 4964-74 (см. табл.13).
______________
* В случае отсутствия микробиолога на предприятии контроль может осуществляться на хоздоговорных началах местной СЭС.

3.3.2. Кроме того, ежедневно осуществляют проверку правильности термического режима пастеризации молока и сливок по термограммам каждого пастеризационного аппарата и при наличии отклонений от принятого режима выясняют причины и сообщают об этом техническому руководству предприятия для принятия мер.

3.3.3. Эффективность пастеризации молока и сливок контролируют вне зависимости от качества готового продукта не реже одного раза в декаду. 10 мл молока, отобранного после секции охлаждения, засевают в 50 мл среды Кесслер. Бактерии группы кишечной палочки не должны обнаруживаться в указанном объеме молока, проба на фосфатазу должна быть отрицательной.

Общее количество бактерий в 1 мл молока, отобранного после секции охлаждения пастеризатора, не должно превышать 10 тыс.

Ответственность за правильное проведение пастеризации несут как работники по подготовке оборудования (мойке и термической обработке), так и работники, проводившие пастеризацию молока.

3.3.4. Одновременно с отбором проб для микробиологического исследования молока и сливок в оригинальной упаковке после розлива отбирают и исследуют пробы от данных партий этих продуктов из емкостей перед розливом. Эти исследования проводят с целью установления мест микробиологического обсеменения продукта (т.е. выяснения, за счет оборудования какого цеха произошло это обсеменение) в случае пониженного качества его по микробиологическим показателям.

Микробиологический контроль производства кисломолочных продуктов состоит в проведении анализов молока, предназначенного для заквашивания (на наличие бактерий группы кишечной палочки), закваски, полуфабрикатов и готовой продукции (на наличие бактерий группы кишечной палочки и состав микрофлоры).

При производстве кисломолочных продуктов исключительную роль играет специфическая технически важная микрофлора - микроорганизмы закваски и пастеризованного молока, формирующие физико-химические и органолептические свойства продукции. Контроль развития этой микрофлоры занимает также большое место при производстве кисломолочных продуктов.

Готовую продукцию контролируют на наличие бактерий группы кишечной палочки и по микроскопическому препарату от одной-двух партий не реже одного раза в 5 дней.

3.4.1. Кефир, простокваша, ряженка, варенец, йогурт и др. Контроль технологического процесса производства этих кисломолочных продуктов проводится один раз в месяц. При этом проверяют эффективность пастеризации молока (по общему количеству бактерий и бродильному титру). Контроль термограмм со всех работающих пастеризационных установок производится ежедневно.

Кишечная палочка не должна обнаруживаться в 10 мл молока, отобранного после пастеризации.

Закваску проверяют по всем показателям, перечисленным выше (см. контроль закваски, п.2.14 и 2.16).

В молоке перед внесением закваски (из ванны, танка) определяют наличие бактерий группы кишечной палочки (в 1 и 0,1 мл). Закваску и молоко после внесения закваски контролируют на наличие бактерий группы кишечной палочки по бродильной пробе.

Для выработки кефира с бродильным титром не менее 0,3 мл необходимо, чтобы бродильный титр заквашенного молока был более 0,3 мл. Во время розлива отбирают одновременно пробы из ванн (танков) с заквашенным молоком и бутылки с конвейера разливочных автоматов и проверяют их по бродильной пробе.

Одновременно со взятием проб для контроля технологического процесса берут пробы для контроля санитарно-гигиенического состояния цеха (эффективность мойки оборудования, посуды, чистоты воздуха, личной гигиены работников цеха и т.д.).

Микробиологические показатели готовой продукции должны по коли-титру быть не ниже 0,3 мл.

3.4.2. Творог. При контроле технологического процесса производства творога не реже одного раза в месяц контролируют на наличие бактерий группы кишечной палочки молоко пастеризованное из ванны до заквашивания, молоко после заквашивания, сгусток и творог. Закваску контролируют ежедневно. В случаях появления в готовом продукте порока "излишняя кислотность" пастеризованное молоко и закваску проверяют на наличие термоустойчивых палочек; в случаях появления в продукции порока "вспучивание" - на наличие дрожжей.

Творог после прессования проверяют по бродильной пробе, а после охлаждения - по бродильной пробе и микроскопическому препарату.

Одновременно со взятием проб для контроля технологического процесса берут пробы для проверки санитарно-гигиенического состояния цеха и наличия на оборудовании термоустойчивых молочнокислых палочек и дрожжей (в случае появления в продукции пороков - излишняя кислотность и вспучивание) (п.2.18).

3.4.3. Сметана. Контроль производства сметаны осуществляют не реже одного раза в месяц. Проверяют эффективность пастеризации сливок (по общему количеству бактерий и по бродильному титру); сливки перед заквашиванием по тем же показателям, а также на наличие термоустойчивых молочнокислых палочек в случае появления в продукции порока излишняя кислотность (см. п.2.17) и дрожжей - в случае появления в продукции порока вспучивание.

По ходу технологического процесса контролируют закваску, сливки после заквашивания и сметану после охлаждения (готовый продукт). В случае использования сырья для нормализации (сметаны, сливок) его также проверяют по бродильной пробе и на наличие термоустойчивых палочек и дрожжей, если отмечается появление соответствующих пороков в продукции. Санитарно-гигиеническое состояние цеха и наличие на оборудовании технически важной микрофлоры проверяют одновременно с проведением контроля сырья, полуфабрикатов и готовой продукции по ходу технологического процесса.

3.4.4. При выработке творога сычужно-кислотным способом удовлетворительным по микробиологическим показателям можно считать творог с бродильным титром 0,001-0,0001 г.

При оценке сметаны по микробиологическим показателям ориентировочной нормой можно считать бродильный титр 0,01-0,001 г.

В микроскопическом препарате творога и сметаны высшего сорта должны обнаруживаться стрептококки, для творога первого сорта допускается наличие единичных палочек.

3.5.1. В сыром молоке, поступающем на сыродельные заводы, кроме редуктазной пробы, производят один раз в декаду, а в случае необходимости и чаще, пробу на маслянокислые бактерии, сычужно-бродильную и пробу на брожение и определяют бродильный титр.

В молоке непосредственно после пастеризации не реже одного раза в декаду определяют бродильный титр и наличие маслянокислых бактерий. Кишечная палочка в 10 мл пастеризованного молока должна отсутствовать, а маслянокислые бактерии не должны обнаруживаться в 0,1 мл.

3.5.2. Сыр после прессования и в конце созревания контролируется согласно Приложению 1.

3.5.3. Контроль производства плавленого сыра. В готовом продукте не реже одного раза в месяц, а в случае необходимости и чаще, производят посев на общее количество бактерий, наличие маслянокислых и бактерий группы кишечной палочки. Общее количество бактерий в 1 г готового продукта ориентировочно не должно превышать 10000 клеток. При бродильном титре не ниже 0,1 г сыр можно считать удовлетворительным по микробиологическим показателям.

3.6.1. В сливках до и после пастеризации определяют общее количество бактерий и бродильный титр не реже одного раза в месяц. Общее количество бактерий после пастеризатора в 1 мл сливок хорошего качества допускается до 1000, а сливок удовлетворительного качества до 5000. Бактерии группы кишечной палочки должны отсутствовать в 10 мл сливок.

В сливках после охладителя (способ сбивания), в сливках из-под сепаратора (способ преобразования высокожирных сливок) и в сливках перед сбиванием определяют общее количество бактерий и бродильный титр не реже одного раза в месяц. Общее количество бактерий в 1 мл пастеризованных сливок хорошего качества может достигать до 10 тыс. а в 1 мл сливок удовлетворительного качества - до 75 тыс.

3.6.2. В масле два раза в месяц определяют количество протеолитических бактерий, дрожжей, плесеней и бродильный титр. В сладкосливочном масле два раза в месяц определяют также и общее количество бактерий. В масле, аттестованном на государственный Знак качества, общее количество бактерий и титр бактерий группы кишечной палочки определяют не реже одного раза в 10 дней. Микробиологические показатели оценки масла помещены в приложении 3.

Сгущенное молоко с сахаром, с какао, кофе - это продукты, в которых консервирующую роль играет сахар. Основной микрофлорой этих продуктов является остаточная микрофлора молока после пастеризации, а также микрофлора, попадающая в продукт при прохождении его через оборудование.

Поэтому основной задачей санитарно-гигиенического контроля производства молочных консервов является получение продуктов с минимальным количеством микрофлоры, так как при хранении сгущенного молока с сахаром, содержащего некоторые виды микроорганизмов (микрококки, дрожжи, маслянокислые бактерии и др.), могут появиться различные пороки (прогорклый вкус, "бомбаж").

Не реже одного раза в декаду контролируется сырье, направляемое на выработку сгущенного молока с сахаром, с какао, с кофе. Каждая партия молочных консервов контролируется на общее количество бактерий и титр кишечной палочки по ГОСТ 9225-68.

По содержанию дрожжей и плесеней сгущенное молоко с сахаром контролируется один раз в 5 дней. При подозрении обсеменения сгущенного молока с сахаром дрожжами или высеве их из отдельных партий сгущенного молока с сахаром необходимо контролировать каждую партию на наличие дрожжей и плесеней.

Партии сгущенного молока с сахаром, экспортируемые в зарубежные страны, рекомендуется выдержать в течение 10 дней при 25 °С, а затем в них определить наличие дрожжей.

По микробиологическим показателям сгущенные молочные консервы должны удовлетворять требованиям ГОСТов:

сливки сгущенные с сахаром - общее количество микроорганизмов в 1 г не более 35 тыс. титр кишечной палочки не ниже 0,3; ГОСТ 4937-60*;
______________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 4937-85. - Примечание изготовителя базы данных.

какао со сгущенным молоком и сахаром и кофе натуральный со сгущенным молоком и сахаром - общее количество микроорганизмов в 1 г не более 35 тыс. титр кишечной палочки не ниже 0,3; ГОСТ 718-54*, ГОСТ 719-54*;
________________
* На территории Российской Федерации действуют ГОСТ 718-84 и ГОСТ 719-85. соответственно. - Примечание изготовителя базы данных.

сгущенное цельное молоко с сахаром - общее количество бактерий в 1 г не более 50 тыс. титр кишечной палочки не ниже 0,3, ГОСТ 2903-55*;
______________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 2903-78. - Примечание изготовителя базы данных.

сгущенное цельное молоко с сахаром (продукция с государственным Знаком качества) - общее количество бактерий в 1 г продукта не более 25 тыс. бактерии группы кишечной палочки в 1 г продукта не допускаются, ГОСТ 5.50-67 .

Эффективность пастеризации молока контролируется вне зависимости от качества готового продукта, не реже 3 раз в месяц. В 10 мл молока, отобранного после секции охлаждения пастеризатора, кишечная палочка не должна обнаруживаться, проба на фосфатазу в танке должна быть отрицательной.

Контроль технологического процесса производства сгущенных молочных консервов рекомендуется проводить не реже одного раза в месяц. Если же микробиологические показатели готовой продукции ухудшились, то необходимо проверку технологических процессов проводить чаще, с целью установления мест микробиологического обсеменения продукта.

Одновременно с отбором проб для контроля технологического процесса берут пробы для контроля санитарно-гигиенического состояния цеха (эффективность мойки оборудования, посуды, чистота воздуха, личная гигиена работников цеха и т.д. При контроле чистоты мойки оборудования необходимо, помимо бродильного титра и общего количества бактерий, определять и количество дрожжей, т.к. попадание дрожжей в сгущенное молоко с сахаром может при дальнейшем хранении вызвать "бомбаж").

В группу сухих молочных консервов входят следующие продукты: цельное и обезжиренное сухое молоко, сухие сливки и высокожирные с сахаром и без сахара, сухая диетическая простокваша, а также молоко сухое для детского питания, сухие смеси для мороженого, сухие молочные смеси "Малыш" и "Малютка".

Основной микрофлорой сухих молочных консервов (кроме сухой диетической простокваши) является остаточная микрофлора молока после пастеризации и микрофлора, попадающая с оборудования и при расфасовке. Поэтому санитарно-гигиенический контроль производства сухих молочных консервов проводится с целью получения продуктов с минимальным обсеменением и стойких при хранении. Контроль сырья, направляемого на выработку сухих молочных продуктов, производится не реже одного раза в декаду. В каждой партии сухих молочных консервов определяют общее количество бактерий и содержание бактерий группы кишечной палочки. При контроле детских сухих молочных смесей выборочно один раз в неделю определяется количество протеолитических бактерий, дрожжей и плесеней.

Микробиологические показатели сухих молочных консервов должны удовлетворять требованиям ГОСТов:

сухое цельное молоко - общее количество микроорганизмов в 1 г продукта не более 50 тыс. (для высшего сорта) и не более 70 тыс. (для первого сорта), содержание бактерий группы кишечной палочки не допускается в 0,1 г - ГОСТ 4495-74;

сухое обезжиренное молоко - общее количество микроорганизмов в 1 г продукта не более 50 тыс. (сухое молоко для непосредственного потребления) и не более 100 тыс. (сухое молоко для промышленной переработки). Содержание бактерий группы кишечной палочки не допускается в 0,1 г - ГОСТ 10970-74*;
______________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52791-2007. - Примечание изготовителя базы данных.

сливки сухие и сливки сухие с сахаром - общее количество микроорганизмов в 1 г продукта не более 50 тыс. (высшей сорт) и не более 100 тыс. (первый сорт) - ГОСТ 1349-58*;
______________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 1349-85. - Примечание изготовителя базы данных.

ЗЦМ - общее количество микроорганизмов в 1 г продукта не более 50 тыс. титр бактерий группы кишечной палочки не ниже 0,3 (при посеве продукта в три пробирки по 0,1 г в каждую бактерии группы кишечной палочки допускаются не более чем в одной пробирке) - ТУ 181-71;

сухие молочные смеси "Малыш" и "Малютка" - общее количество микроорганизмов в 1 г продукта не более 25 тыс. содержание бактерий группы кишечной палочки не допускается в 1 г - ОСТ 4943-72;

каша сухая молочная "Малыш" - общее количество микроорганизмов в 1 г продукта не более 50 тыс. бактерии группы кишечной палочки не допускаются в 0,3 г.

Проверка эффективности пастеризации молока (по общему количеству бактерий и бродильному титру) проводится не реже 3 раз в месяц. Бактерии группы кишечной палочки не должны обнаруживаться в 10 мл молока, отобранного после пастеризации.

Контроль технологического процесса производства сухих молочных консервов рекомендуется проводить не реже одного раза в месяц. Если микробиологические показатели готовой продукции ухудшились, то проверку технологических режимов производят чаще для установления мест микробиологического обсеменения продукта.

При выработке сухой диетической простокваши производят еще дополнительно контроль качества закваски по всем показателям, предусмотренным в п.2.15; 2.16.

3.9.1. В большинстве случаев при ежедневном контроле чистоты мойки посуды и оборудования можно ограничиваться одним анализом на присутствие бактерий группы кишечной палочки путем посева (не реже трех раз в месяц) на среду Кесслер. Оценка качества чистоты мойки будет считаться неудовлетворительной при появлении газа и удовлетворительной - при его отсутствии.

Если к чистоте оборудования (ванны и трубы для закваски, диетпродуктов; танки и трубопроводы для пастеризованного молока и сливок, оборудование для молочноконсервных заводов) предъявляются особые требования и при его контроле в среде Кесслер, как правило, не наблюдается брожения, качество мойки оборудования оценивают по общему количеству бактерий в смывах.

Санитарно-гигиенический контроль состояния производства должен быть организован таким образом, чтобы можно было оценить качество мойки и дезинфекции, проводимой каждым отдельным работником. Поэтому необходимо не реже 3 раз в месяц контролировать работу каждого работника.

3.9.2. Чистоту рук работников контролируют не реже 3 раз в месяц. Примерные микробиологические показатели для оценки санитарного состояния производства помещены в приложении 5.

3.10.1. Не реже одного раза в квартал (при пользовании городским водопроводом) и одного раза в месяц (при наличии собственного источника водоснабжения или использовании воды из запасного резервуара) определяют общее количество бактерий и бактерий группы кишечной палочки в воде по ГОСТ 18963-73. "Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа".

На заводах, где вырабатывается масло способом сбивания и применяется промывка этого продукта, общее количество бактерий группы кишечной палочки и титр кишечной палочки в воде определяют один раз в месяц.

Согласно действующему ГОСТ 2874-73 в 1 мл питьевой воды не должно содержаться более 100 бактерий, а титр бактерий группы кишечной палочки должен быть не менее 300.

3.10.2. В воздухе заводских помещений определяют общее количество бактерий, количество дрожжей и плесеней не реже одного раза в месяц; в расфасовочных цехах детских молочных продуктов и сгущенного молока с сахаром не реже 3 раз в месяц.

Примерные микробиологические показатели оценки воздуха в помещении указаны в приложении 6.

Каждую партию материалов, припасов, применяемых на производстве, подвергают микробиологическому контролю на общее количество бактерий и бродильный титр, а также в том случае, если при контроле технологических процессов и готовой продукции выявляется необходимость проверить, не являются ли припасы, материалы источником микробиологического обсеменения.

В необходимых случаях производят дополнительное микробиологическое исследование на специфическую для данного вида материалов, припасов микрофлору, например дрожжи и плесени для сахара.

Примерные микробиологические показатели для оценки результатов микробиологического контроля материалов и припасов помещены в приложении 7.

Схема организации микробиологического контроля дана в приложении 1.

Все данные микробиологического контроля производства записывают в журналы.

Лабораторные журналы должны быть прошнурованы, страницы пронумерованы и скреплены печатью. Записи в журналах должны вестись четко, чернилами.

Журналы находятся на ответственном хранении у микробиолога.

По истечении года вся документация сдается по акту в заводской архив. Формы журналов даны в приложениях 8-15.

Микробиологическая лаборатория цельномолочного, маслодельно-сыродельного и молочноконсервного предприятий должна быть полностью обеспечена лабораторным оборудованием, посудой, реактивами и другим необходимым инвентарем. Список лабораторного оборудования приводится в приложении 2.